分型方法
HCV的分型方法主要有PCR依賴的基因分型方法和血清型分型方法兩大類。
1.基因分型方法
(1)全基因序列測定分型:是確定HCV基因型最直接、最準確的方法,通過全序列的測定,可以全面的分析不同的HCV毒株,再與其他已知基因型的HCV株進行核苷酸同源性比較,從而進行分型。此分型方法對樣本要求高,不能大量進行,常用於研究工作。
(2)引物特異性PCR法後再作基因分型法:首先用一對通用引物,擴增產物為292個核苷酸,每個擴增循環為94℃變性1分鐘,55℃復性1.5分鐘,及引物延伸反應72℃2分鐘,共進行35個循環。取第一次PCR反應產物進行第二次PCR,在反應混合物中有一個通用引物和4個型特異性引物。在第一次PCR擴增,選擇能擴增出各型為同長的片段,再在此基礎上利用型特異性引物進行第二次PCR,並根據擴增產物的長短進行分型。
(3)5’末端非編碼區酶切分型:常用的方法是限制性片段長度多態性法的分型法,即利用不同基因型的HCV,分別有其特異性的切斷基因序列的酶,切割後進行電泳可得到酶切後的特異片段圖譜,並根據圖譜進行分型。
(4)HCV NS5b基因分型:不同基因型NS5基因變異有一定的規律,以NS5b的PCR產物直接測序進行基因分型證實,1a、1b、2a、2b、3a、1b與2a和1b與3a混合感染等不同基因型,具有特異的限制性內切酶位點,可分別的採取酶切分型。
(5)以特異性核酸探針進行雜交分型:由Enomoto採用的HCV分型,即Ⅱ型和Ⅱ型PCR產物,其長度為400bp作為探針,與被檢標本的PCR產物進行核酸分子雜交,其結果即可分為K1即Ⅰ型、K2a為Ⅱ型。操作複雜,成本高,不常採用。
2.血清型分型
(1)核心區Cp9陽性血清分型:選用HCV高保守區,分別合成1、2型肽。第65至81位胺基酸序列合成2條,具有17個胺基酸。先用5’末端非編碼區引物的RT-PCR,得到陽性PCR產物,按常規酶標法測得抗-HCV Cp9陽性後,再分別對以上兩條分別包被的肽進行再測定。
(2)加入NS4區合成寡肽建立檢測C型肝炎抗體分型試劑:用ELISA法來合成NS4區序列,合成的NS4區序列相當於第1690位至1719位胺基酸。將四條合成肽分別包被於酶標板,經4℃孵育過夜,用150mmol/L 的NaCl,0.05%的Tween-20清洗標板5次,常溫封閉2小時後,將血清標本1:10稀釋加入反應板,每一份標本分別加入包被不同抗原的4個孔內,為減少不同血清型抗-HCV的交叉反應,每孔內加相應抑制液5μL,常溫振盪孵育1小時,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG,常溫振盪孵育1小時,洗板後再加入OPD顯色劑100μL/孔,室溫避光顯色15分鐘,在492nm波長下測定光密度,cut off值測定健康人血清,以光密度均值加2SE來確定檢測結果。
臨床意義
1.基因型分布概況
全世界HCV基因型已公認的有Ⅰ/1a、Ⅱ/1b、Ⅲ/2a、Ⅳ/2b、Ⅴ/3a及Ⅵ/3b型。但還沒有統一。我國情況,除Ⅱ/1b和Ⅲ/2a占大多數外,極少數地區有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型存在。整體上看南方約占80%為Ⅱ型,北方50%為Ⅲ型。
2.流行病學意義
國內外均證明了HCV母嬰傳播的存在,母子所感染的型是一致的,也有人證明家庭內傳播的可能性,主要傳播途徑為輸血。
3.基因分型與抗病毒治療效果的關係
不同基因型患者用干擾素治療其療效明顯不同,Ⅲ型患者有效率可達85%,Ⅳ型患者有效率可達70%,而Ⅱ型患者僅有40%。
4.基因分型與疫苗研究的關係
HCV RNA基因組變異很大,尤其是編碼外殼蛋白E區變異,且地域性不同導致的基因型差異為疫苗研製帶來了困難。