簡介
FISH技術： 螢光標記的原位雜交技術
1974年Evans首次將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合套用，提高了定位的準確性。20世紀70年代後期人們開始探討螢光標記的原位雜交，即FISH技術。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上，標誌著染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代，隨著人類基因組計畫的進行，由於繪製高分辨人類基因組圖譜的需要，FISH技術得到了迅速的發展和廣泛套用。
原理
將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與螢光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經螢光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
實驗流程
FISH樣本的製備→探針的製備→探針標記→雜交→染色體顯帶→螢光顯微鏡檢測→結果分析。
特點
原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在於對製備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間解析度不高、及同位素操作較繁瑣等。採用螢光標記系統則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系，具有以下優點:1、螢光試劑和探針經濟、安全；2、探針穩定，一次標記後可在兩年內使用；3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。
缺點：不能達到100%雜交，特別是在套用較短的cDNA探針時效率明顯下降。
套用
該技術不但可用於已知基因或序列的染色體定位，而且也可用於未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。
螢光原位雜交（FISH）技術的發展和進步
FISH技術顯示核酸是在同位素標記探針的基礎上改進而來的。早期的同位素標記沒有專門的標記方法，如將隨機同位素標記的鹼基添加到生長的細胞中之後再進行放射自顯影。同位素雜交的諸多缺點必然要求用更好的技術來取而代之。首先，放射性材料決定了探針的不穩定性，特別是半衰期較短的同位素隨著時間推移不斷衰退而造成探針的活性不能持久。其次，雖然放射顯影的靈敏度極高，但是解析度（清晰度）有限。第三，為了在放射顯影底片上獲得可檢測到的信號往往需要延長曝光時間，使檢測周期變長。第四，放射性標記探針相對比較昂貴，並且必須按照嚴格的程式轉運、貯存、處理帶有放射性的材料。而FISH 技術在解析度、檢測周期、安全性等方面明顯得到了改進，並為以後的多位點檢測、高質量分析、活細胞繪圖等打下了基礎。
1980 年，Bauman 首次將螢光原位雜交用於核酸檢測，直接將RNA-3’端用螢光素標記作為特異DNA 序列的探針 。嵌入整個探針的酶結合螢光素標記鹼基方法已經廣泛用於螢光探針的製備；一次可以標記一種顏色。氨基-烯丙基標記鹼基技術可以與任何半抗原或者螢光素結合，這對於原位雜交是至關重要的，因為氨基-烯丙基標記的鹼基技術可以僅通過簡單的化學反應就可以獲得一系列的低背景信號探針，通過雜交探針的二級檢測系統使得雜交信號被放大。早在19 世紀80 年代，缺口平移法檢測、生物素標記探針，二級螢光標記抗體檢測等方法已經用於DNA 和mRNA檢測。約十年後，單鏈DNA 探針的合成、標記方法的不斷改進可以使合成的雜交探針攜帶大量的螢光素分子用於直接檢測。在這些方法基礎上，有許多關於不同的檢測範圍、特異性，靈敏度以及解析度等直接的或間接的改進技術方面的報導。
1 FISH 技術檢測位點數目及檢測目標的發展
在FISH 技術基本確立之後，FISH 不僅用於單基因或核酸檢測，FISH 技術的進一步發展擴展到多色FISH 多基因位點同時檢測，從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞中轉錄產物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測，並且在今後的研究中還有可能套用到整個生物體的檢測。早期的探針較大，是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和隨機引物DNA 合成法來製備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重複序列造成高螢光背景，採用未標記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用於抑制非特異性雜交可以克服上述問題，同時也使得研究者擴大了檢測目標，實現了整條染色體染色。在細胞遺傳學上FISH 技術在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交（Comparativegenomic hybridization）用於檢測染色體區域的缺失和重複。大片段探針一旦和樣品非特異性結合就會形成一個信號，混淆染色體上基因的檢測，就需要剪下成小片段<200核苷酸。現在檢測手段的提高以及檢測軟體的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低，靈敏度越來越高。精確的計算機圖片處理算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。隨著檢測目標越來越小，FISH技術已用於隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。
FISH 檢測範圍的擴大，使得FISH 技術的套用在20 世紀90 年代急速增長。由FISH 技術套用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。首先是採用不同的螢光素來檢測多位點，如雙色螢光用於檢測特異的核酸序列，每一條染色體、基因或者轉錄產物分別由一種可以分辨的螢光信號來表示。之後是採用兩種色彩解碼方案進一步擴大了FISH 套用範圍。解碼方案主要是針對色彩比例，即每一種顏色在總顏色中所占的比例來描繪多位點。前述的每一種方法，或是兩種方法的結合都已經將可檢測位點多達12 個。採用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表著FISH 技術多位點檢測的里程碑。儘管可以採用多種方法觀測到mRNAs，但是FISH 對整個轉錄產物的原位分析似乎更有套用前景。色彩解碼技術已經實現了對整個組織的檢測。
2 FISH 技術的定量分析階段
Pinkel 等（1986）首次將螢光圖像定量分析用於基本細胞遺傳檢測，採用雙色激發塊裝置照相機檢測螢光信號，而且定量分析技術很快用於了mRNA 檢測。螢光檢測的關鍵是信號的重現性、無規律性及背景的自發螢光。不僅不同的樣品之間螢光不同，而且同一載玻片上的材料或者同樣的細胞都有可能顯示出不均衡的螢光。目前已有多種方法用於消除一些組織中的自發螢光：如樣品製備過程中，採用的消除自發螢光試劑包括硼氫化鈉或者採用光照輻射進行預處理以消除非特異性背景信號。這些消除自發螢光的方法並不完全有效，通常在進行圖像分析時通過計算機算術除去自發螢光信號。螢光圖像的光譜數據包括真正的信號和許多雜噪，分別進行分析並且通過單獨的光譜組分分析除掉雜噪數據。多色FISH 有自身的限制，包括不同的螢光強度和顏色重疊。但是通過計算機算法分析平衡了多色圖像，包括強度變化和自動糾正信號重疊。
FISH圖像自身的限制並沒有影響到自動破譯算法的發展。採用序列較大探針進行DNA 位點檢測和多色螢光計數算法輔助病理學家實現了自動化分析。此外，檢測探針試劑盒和點計數方法的套用為便捷的檢測結果提供了一個平台。儘管多種方法已經用於分析或最佳化自動細胞檢測系統，人工的細胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。然而，細胞製備、鑑別、固定介質上細胞樣品計算機化檢測在未來的醫學診斷中的高效益性不容忽視，快速檢測細胞內的分子信號只有通過計算機輔助方法進行檢測。現在，自動化檢測程式已經擴展到採用多基因轉錄模型檢測特異的DNA 簇和轉錄位點以確定功能細胞的狀態。
鑒於FISH 起始階段的發展主要是探針類型和檢測位點的擴展，螢光檢測技術將來的發展可能包括檢測領域的擴展。螢光圖像臨床診斷套用需要在檢測體系上進一步提高，如探針的結合，照相和分析的自動化，因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是螢光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。近來的雷射共聚焦顯微鏡和光學X射線斷層攝影技術要求樣品厚度達到1~2mm。一種改進的光學投射X 顯微斷層攝影技術可以獲取到15mm 厚樣品的圖像擴大了生物學和診斷樣品的檢測範圍。活細胞的RNAs FISH 技術檢測也有報導。既可以採用體內釋放的螢光集團也可以採用雜交後探針的螢光素進行檢測。這兩種新方法都可以降低非特異性標記探針存在時的高背景（如活細胞），可以用於追蹤mRNA 的合成和轉移途徑。這些方法較綠色螢光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）更易於檢測不同靶分子。相對於GFP 活細胞原位雜交檢測，FISH 易受到細胞內合成探針的影響。FISH 需要進一步的改進以降低活體基因表達檢測時的干擾背景，避免細胞內自身雜交物的干擾。其實完全可以不必考慮FISH 檢測和螢光檢測蛋白技術的差異，將FISH 技術和螢光蛋白技術結合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。
多光子顯微技術的套用進一步擴大了螢光圖像的套用範圍。採用多光子顯微鏡，雷射塊可以發射光子聚焦於顯微鏡兩到三次激發目的螢光素。採用近紅外激發光可以更深層次穿透生物樣品，比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的套用已將螢光圖像用於活體系統的檢測，甚至整個動物體。由於還不能合成生物體標記探針，因此目前生物體內螢光圖像的套用只限於檢測螢光分子或生物體自發螢光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中產生的自發螢光信號可以作為一種重要的診斷信號。一旦生物體探針成為可能，將會成為鑑別特異核酸序列，進行非入侵診斷，獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。
