概述
聚合酶鏈式反應(PCR):擴增樣品中的DNA量和富集眾多DNA分子中的一個特定的DNA序列的一種技術。在該反應中,使用與目的DNA序列互補的寡核苷酸作為引物,進行多輪的DNA合成。其中包括DNA變性,引物退火和在Taq DNA聚合酶催化下的DNA合成。
DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早於1955年發現 ,而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是於70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發現,但由於此酶不耐高溫,高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現今所使用的酶(簡稱 Taq polymerase), 則是於1976年從溫泉中的細菌(Thermus aquaticus)分離出來的。它的特性就在於能耐高溫,是一個很理想的酶,但它被廣泛運用則於80年代之後。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復複製,它是於1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發表了第一個單純且短暫性基因複製(類似PCR前兩個周期反應)的實驗。而現今所發展出來的PCR則於1983由 Dr. Kary B. Mullis發展出的,Dr. Mullis當年服務於PE公司,因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 並於1985年與 Saiki 等人正式表了第一篇相關的論文。此後,PCR的運用一日千里,相關的論文發表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨後PCR技術在生物科研和臨床套用中得以廣泛套用,成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。
〔PCR原理〕
DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發現,DNA在高溫時由於兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復形成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,並設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。
但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的套用和發展。
發現耐熱DNA聚契約酶--Taq酶對於PCR的套用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量套用,並逐步套用於臨床。
〔PCR步驟〕
標準的PCR過程分為三步:
1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。
2.退火(25℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。
3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳,也能在很短的時間內複製完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。
〔PCR檢測〕
PCR反應擴增出了高的拷貝數,下一步檢測就成了關鍵。螢光素(溴乙錠)染色凝膠電泳是最最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。近年來以螢光探針為代表的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。
PS:
聚合酶鏈式反應(polymerase Chain Reaction ,PCR)
三步:
1 變性:模板DNA加熱變性
2 退火 引物與它的靶序列發生退火,引物DNA量多,使引物和模板在局部形成雜交鏈
3 延伸 4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下,DNA合成酶催化以引物為起始點,按5'-3'方向進行延伸。
上面三步為一個循環,可使拷貝數到達2*E-6-2*E-7
PCR 產物一段雙鏈DNA,是由它的末端引物的5’端決定的。
1.首輪擴增,其產物是大小不均一的DNA分子。長度應大於兩引物之間的長度。
在第二個循環中,如圖3,由於5'固定,其產物長度就由等於兩引物之間的長度。所以幾十個循環後就會產生大量的兩引物之間序列。
引物設計:
1,長度15~30個核苷酸,最多到50個核苷酸左右。(50?為什麼?反正太長也沒有必要)
2, 儘量避免嘌呤和嘧啶堆積的現象。(其實有時很難避免,不是很重要)。
3,引物內部不應該形成二級結構,如果引物中有酶切位點時,就會出現引物二聚體。(一般不是很重要)
PCR的反應條件
1,dNTP濃度過高會加快反應速度,但同時還可以增加鹼基的錯誤摻入率。
2, 引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。
3,TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增,低則合成產物量減少。
TaqDNA聚合酶無校正功能,摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。
4, 在90~95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94~95度30~60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。
5,DNA很快冷卻到40~60度使引物和模板結合。引物長度在15~25時退火溫度
Tm=4(G+c)+(A+T),一般在45~55度,溫度低容易退火但特異性低;溫度高,不容易退火但特異性高。退火時間30秒。
6,延伸溫度一般在70~75度這時TaqDNA聚合酶活性最高(150個/S),當引物在16個鹼基以下時可採用緩慢升高溫度到70~75度的方法,使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當〈1KB時在較後的循環中延長擴增時間。
7:循環次數25~30次。
無產物時:
1,取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增。
2,增加TaqDNA聚合酶濃度
3,增加循環次數
4,降低退火溫度
5,加靶DNA量