鼠肝
正文
鼠肝(《本草經集注》)
來源
為鼠科動物褐家鼠、黑家鼠等的肝。動物形態詳"鼠"條。功用主治
①《本草經集注》："治產難。"②《綱目》："治箭鏃不出，搗塗之。"
中醫研究
目的
觀測中藥肝復健沖劑對二乙基亞硝胺（DEN）誘導大鼠肝纖維化形成的影響.方法
建立DEN誘導大鼠肝硬化模型，同時給予肝復健沖劑進行干預，套用天狼紅苦味酸特染法、免疫組化染色法及計算機圖像分析技術檢測中藥對DEN致大鼠肝纖維化過程膠原沉澱及肝細胞增殖特性的影響.1材料和方法
1.1材料SD雄性大鼠，體質量150~180g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供.二乙基亞硝胺(DEN)購自Sigma公司.天狼紅（解放軍第475醫院贈送）.PCNA檢測試劑盒購自DAKO公司.中藥飼料：肝復健沖劑按30.4g？kg-1均勻混合於基礎飼料中壓制而成（第四軍醫大學實驗動物中心提供）.
1.2方法
1.2.1模型建立大鼠適應環境3d隨機分為模型組（Model）及中藥組(Ganfujian，GFJ)，每組各30隻，分別以0.1g·L-1DEN自由飲水，同時分別給予基礎飼料或含中藥的飼料餵養.16wk時停用DEN飲水及中藥飼料.考慮到造模過程大鼠有一定死亡率，分別於建模開始後每4wk兩組各處死5隻大鼠，剩餘大鼠留繼續觀察.取肝組織固定於100g·L-1甲醛溶液，石蠟包埋，切片厚4μm.常規HE染色、切片膠原特殊染色及免疫組化染色.
1.2.2切片膠原染色按天狼紅飽和苦味酸法[4].普通石蠟切片，厚4μm；常規脫蠟至水，0.1mol？L-1天狼紅飽和苦味酸，避光室溫孵育20min；不洗，950mL？L-1乙醇脫水，二甲苯透明，封片.
1.2.3PCNA免疫組織化學染色取材肝組織固定於100mL？L-1緩衝甲醛溶液24h，常規石蠟包埋，切4μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水；染色方法為免疫ABC法.以0.1mol？L-1PBS取代一抗作陰性對照，以正常大鼠肝組織作正常對照.
1.2.4染色結果判定及計算機圖像分析肝臟背景為淡黃色，膠原陽性著色呈紅色，採用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文分析系統，隨機選擇5個匯管區進行染色膠原的定量分析(面積占視野面積)，取其均值.PCNA陽性著色為覆蓋胞核的棕黃色顆粒.用格線（10×10）測試法計數陽性肝細胞.切片各選擇10個按同一方向移行、不重疊的高倍鏡視野（×40），記數陽性及陰性細胞數（100個細胞）.
統計學處理
採用SPSS統計分析軟體對所獲得的數據進行組間秩和檢驗.
結果
2.1大鼠肝纖維化過程組織形態學變化模型組大鼠使用DEN4~8wk時肝表面由平滑逐漸變為粗糙，可見小顆粒，呈局灶性.光鏡下肝細胞腫脹，空泡變性，局灶性壞死，伴炎細胞浸潤，並逐漸出現纖維組織增生.12wk時40%大鼠已出現明顯肝硬化，肝表面更加粗糙，肝臟增大、腫脹，色暗或淡.16wk時大鼠均有肝硬化表現，結節增多變大，肝臟縮小，組織學有大量形態不一，大小排列不齊的假小葉形成.部分大鼠肝臟已出現早期癌結節，鏡下可見少量癌細胞增生.中藥組大鼠各時期肝臟損害均較單純誘導組輕，12wk無肝硬化大鼠，16wk50%大鼠出現肝硬化，但未發現癌變.2.2大鼠肝纖維化過程肝內膠原沉積變化模型組大鼠4wk肝內即出現少量紅色膠原陽性染色，多集中於匯管區.隨著肝內病變加重，假小葉的形成，肝臟沉積的膠原逐漸增多，16wk病變以結節性肝硬化為主，切片膠原沉積量亦達到頂峰.中藥組大鼠肝內病變較模型組明顯減輕，肝硬化發生晚，肝內膠原沉積量少，在4wk及12wk兩組間差異有統計學意義(P<；0.05，Tab1).
2.3大鼠肝纖維化過程肝細胞陽性表達PCNA情況在模型初期即可見少量肝細胞PCNA陽性著色，隨著模型進展，大鼠肝臟PCNA陽性表達的肝細胞數目逐漸增加，並在12～16wk呈明顯攀升趨勢.中藥組大鼠PCNA陽性的肝細胞數在各期均低於模型組，其中12～16wk差異顯著(P<；0.05，Tab2).
討論
肝纖維化是許多慢性肝病重要的中間環節，是由於肝內纖維生成與降解失衡，致使過多的膠原在肝內沉積，常伴於炎症並可發展為肝硬化.肝纖維化形成作為肝硬化發展過程中的一個重要現象，與肝硬變的發展是平行的[5]，因此肝纖維化程度的精確了解是慢性肝病研究不可少的.然而常用的血清學指標和組織學纖維化分級標準卻難以直接、準確反映肝臟內膠原沉積變化.本文採用切片膠原圖像定量處理方法具有準確、客觀、數據可信度高等特點，能精確反映肝內膠原沉積（主要為I，III型膠原）變化[4].本實驗中套用該法檢測DEN誘導大鼠肝纖維化過程中肝內膠原沉積的變化，結果顯示隨著肝細胞變性、炎症高峰到橋接性壞死、肝硬化形成，肝臟形態學改變與膠原沉積呈同步變化.細胞的異常增殖是癌變發生的主要特徵.PCNA是一種從細胞核中分離純化出來的多肽鏈，直接參與細胞增殖過程中的DNA複製，其含量和陽性表達是反應G1晚期和S早期肝細胞增殖的常用指標[6-8].在本模型中初期即出現少量肝細胞PCNA陽性著色，而隨著模型進展，尤其在12~16wk（肝硬化期）PCNA陽性肝細胞數明顯增加，與肝內病變進展呈一致變化.即隨著肝硬化的形成，異常增殖肝細胞數目呈明顯增加趨勢，提示從肝臟炎性改變、肝纖維化至肝硬化的形成，異常增殖的肝細胞數目不斷增加，癌變的可能性亦逐漸增加.
近年來中醫藥防治肝纖維化取得了不少進展，也積累了豐富的經驗，從單味藥、複方及其有效成份等入手，初步發現活血化瘀與扶正補虛兩類中藥具有良好的防治肝纖維化作用.由於採用中草藥治療慢性肝病在臨床上有肯定療效，且又具有無明顯毒性反應或副作用的優點，因此，是防治肝纖維化較有希望的治療手段，已引起國內外肝病研究人員的極大興趣[9].健脾扶正法是防治肝硬化與肝癌最常用的方法之一，曾證明對肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病變的發生可能有一定的預防作用[10-12].肝復健沖劑以健脾益氣立法，組方均為藥食同源中藥，具有低毒、可長期服用的特點.本實驗結果顯示該沖劑可明顯減少肝內膠原沉積，延緩化學致癌物DEN所致大鼠肝纖維化過程，同時對肝硬化形成期陽性表達PCNA的肝細胞數目亦有顯著抑制作用.提示該沖劑可通過減輕化學物質引起的肝內炎性病變，減少肝內以I、III型為主的膠原沉積，延緩和減輕肝纖維化過程，同時可抑制肝硬化形成及演變期肝細胞可能的惡性增殖，達到阻抑肝硬化形成及其繼續發展為肝癌的作用.
其他研究
大蒜素是強效抗氧化劑，目前國內外研究顯示它能增強肝臟谷胱甘肽抗氧化系統功能，能拮抗乙醇氧化性肝損傷。本研究通過對肝臟病理學、超微結構、細胞外基質與肝纖維化相關指標的觀測研究大蒜素對肝纖維化的防治作用。材料和方法
1、材料：SD大鼠46隻，雌雄兼用，體重220-260g，由蘇州大學實驗動物中心提供。大蒜素微粒：江蘇省靖江製藥廠提供，批號：2001011.2。秋水仙鹼：昆明製藥有限公司，批號：980732，規格：0.5mg/片。二甲基亞硝胺(DMN)：上海開明化學廠生產化學純，批號：0161072。酶聯免疫檢測試劑盒等均由上海森雄科技實業有限公司提供。
2、儀器：
①透視電子顯微鏡CH600，日本Hitachi。②酶標儀：DenleyDragonWellscanMKI芬蘭Labsystems提供。
3、方法
①動物分組：正常對照組(n=6)：予蒸餾水灌胃，生理鹽水腹腔注射；模型組(n=8)：蒸餾水，DMN；小劑量大蒜素預防組(n=8)：予大蒜素11mg·kg-1·d-1，DMN；中劑量大蒜素預防組(n=8)：予大蒜素22mg·kg-1·d-1，DMN；中劑量大蒜素治療組(n=8)：予大蒜素22mg·kg-1．d-1，DMN；秋水仙鹼組(n=8)：予秋水仙鹼0.15mg·kg-1．d-1，DMN。給藥方法：用生理鹽水將DMN配成0．5%的溶液10mg·kg-1·次-l腹腔注射，第1周每天1次，連續3d，第2～4周每周1次，第5、6周均每天1次，連續2d，實驗結束後腹主動脈取血製備血清。採血後取肝臟左葉常規固定備用。將大蒜素用蒸餾水分別配成相應濃度，按10m1·kg-1．次-1灌胃給藥。除大蒜素中劑量治療組在模型建立3周后給藥，余各組在建模開始時同時給藥。②觀測指標及方法：檢測血清丙氨酸轉氨酶(ALT)，天冬氨酸轉氨酶(AST)、白蛋白，I型前膠原肽(PINP)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)和透明質酸(HA)檢測採用雙抗體夾心ABC-ELISA法。層粘連蛋白(LN)檢測採用酶聯免疫競爭法。肝組織HE染色及膠原纖維(V-G)、網狀纖維特殊染色(Gommori)。
結果
1、大蒜素對大鼠肝纖維化模型肝功能影響：模型組血清AST和ALT活性明顯增加，分別為正常對照組的1.7倍(p<；0.01)和1.5倍(p<；0.01)。大蒜素抑制DMN所致的上述改變，可使血清AST和ALT活性完全恢復正常，並能提高血清白蛋白含量，而秋水仙鹼則無降低AST、ALT及升高血清白蛋白含量作用(p>；0.05)。2、大蒜素對大鼠血清纖維化指標的影響：模型組LN、HA、P工NP、PⅢNP較正常組明顯增加(p<；0.05)，大蒜素小、中劑量預防組、中劑量治療組LN、PINP、PⅢNP較模型組明顯下降(p<；0.05)，其中大蒜素中劑量預防組對降低HA、LN、PINP、PⅢNP作用最大。秋水仙鹼組僅對LN、PⅢNP減少作用顯著。
3、大蒜素對肝組織病理學影響：HE染色、Gommori、V-G染色均顯示大蒜素預防和治療組與模型組相比，可明顯減輕纖維化等級及SSS分值。
4、光鏡結果：正常組：肝小葉區域網路狀纖維支架完整，分布規則，無膠原纖維存在。模型組：肝細胞變性壞死，肝小葉結構破壞，纖維組織增生，假小葉形成。大蒜素組：中央靜脈周圍可見纖維組織，未見明顯假小葉形成。
5、電鏡結果：模型組肝細胞萎縮，線粒體固縮或腫脹，細胞內見大量脂滴及空泡樣變，小膽管擴張，膽管上皮增生，微絨毛減少。Disse間隙見多處纖維沉積，肝竇內皮細胞的窗孔消失，內皮細胞下基底膜形成。大蒜素組Disse間隙纖維化明顯減輕，其中中劑量大蒜素組接近正常。
討論
目前研究發現大蒜素對四氯化碳誘發大鼠肝損傷引起的AST和脂質過氧化產物丙二醛水平的升高有明顯的抑制作用，這種作用具有劑量效應關係。血清LN、HA、PINP、PⅢNP是檢測肝纖維化可靠的血清學指標。其中LN、PⅢNP在肝纖維化過程早期出現，常與肝細胞的炎症壞死有關，尤其是LN參與形成肝竇內皮細胞基底膜。而HA、PINP在肝纖維化過程晚期出現，可作為衡量藥物抗肝纖維化效應指標。本組結果示大蒜素各組PINP、PⅢNP、LN均低於模型組，表明其肝內合成纖維受到抑制，肝組織學顯示大蒜素可降低肝纖維化等級及SSS分值。其中以中劑量預防組效果最好，電鏡觀察同樣顯示大蒜素各防治組Disse間隙及肝竇纖維沉積及抑制內皮細胞基底膜形成較模型組明顯好轉。提示大蒜素對實驗性肝纖維化具有一定的預防和治療作用。
大蒜素抗實驗性肝纖維化的可能機制為：①大蒜素具有良好的抗氧化作用。肝細胞損傷可產生脂質過氧化產物如丙二醛等激活肝星狀細胞(HSC)合成膠原。抗氧化治療有利於減輕肝損傷和肝纖維化。本實驗在DMN造模大鼠中觀察到肝功能改善，提示大蒜素可通過抑制脂質過氧化而對肝損傷及纖維化起抑制作用。②間接抑制HSC細胞轉化。HSC在肝受損時被激活，轉化成肌成纖維細胞(MFBLC)。
目前研究認為，大蒜素由於其抗脂質過氧化(LPO)作用使血管內前列腺素(PG)I：明顯增加，PGI：能抑制血小板衍生生長因子(PDGF)激活的DNA合成而抑制血管平滑肌細胞增殖。大蒜素可能通過抑制PDGF激活的DNA合成而抑制HSC的增殖。③大蒜素還能提高纖維蛋白自溶解活性，從而使纖維蛋白降解產物(FDP)增加。本組設立治療組，在肝纖維化造模3周后給藥，結果表明大蒜素治療組肝臟病理組織學檢查及膠原蛋白含量與肝纖維化模型組差異有顯著性，說明大蒜素可能具有促進膠原蛋白降解與膠原纖維重吸收的作用。
