高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）又叫做高壓或高速液相色譜、高分離度液相色譜或近代柱色譜,以液體為流動相，採用高壓輸液系統，是色譜法的一個重要分支。
 島津10A液相色譜儀 |
它是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入待測樣品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離後，依次進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。這種方法已成為化學、生化、醫學、工業、農業、環保、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術，是分析化學、生物化學和環境化學工作者手中必不可少的工具。
發展簡史
1906年俄國植物化學家茨維特（Tswett）首次提出“色譜”（Chromotography）、“色譜圖”（Chromatogram）和“色譜法”（Chromatographic method）的概念。他在論文中寫到：一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，後用純石油醚淋洗，結果按照不同色素的吸附順序在管內觀察到它們相應的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖。
經典液相色譜法30年代以後，相繼出現了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術。
1952年英國學者Martin和Synge 基於他們在分配色譜方面的研究工作，提出了關於氣－液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術向前推進了一大步，這是氣相色譜在此後的十多年間發展十分迅速的原因。
1958年基於Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導致了胺基酸分析儀的出現，這是近代液相色譜的一個重要嘗試，但分離效率尚不理想。
60年代中後期，氣相色譜理論和實踐的發展，以及機械、光學、電子等技術上的進步，液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學鍵合固定相用於液相色譜就出現了HPLC。
70年代中期以後，微處理機技術用於液相色譜，進一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。
90年代以後，生物工程和生命科學在國際和國內的迅速發展，為高效液相色譜技術提出了更多、更新的分離、純化、製備的課題，如人類基因級計畫，蛋白質組學有HPLC作預分離等。
液相色譜理論發展簡況
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。
主要類型
1．吸附色譜(AbsorptionChromatography)2．分配色譜(PartitionChromatography)
3．離子色譜(IonChromatography)
4．體積排阻色譜(SizeExclusionChromatography)
5．親和色譜(AffinityChromatography)
特點
高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點：
〈1〉高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。
〈2〉高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。
〈3〉高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在µL數量級。
〈4〉套用範圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。
〈5〉分析速度快、載液流速快：較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5min內即可完成，一般小於1h。
此外HPLC還有色譜柱可反覆使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。HPLC的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連線管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。HPLC檢測器的靈敏度不及氣相色譜。
基本概念和術語
色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)。基線(baseline)——經流動相衝洗，柱與流動相達到平衡後，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行於時間軸。
噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由於操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。
色譜峰(peak)——組分流經檢測器時回響的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似於對稱形常態分配曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：
前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。
峰底—基線上峰的起點至終點的距離。
峰高(peakheight，h)—峰的最高點至峰底的距離。
峰寬（peakwidth，W)—峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ
半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)—峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
峰面積(peakarea，A)—峰與峰底所包圍的面積。
保留時間(retentiontime，tR)——從進樣開始到某個組分在柱後出現濃度極大值的時間。
理論塔板數(theoreticalplatenumber，N)——用於定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫解析度，表示相鄰兩峰的分離程度。R≥1.5稱為完全分離。
《中國藥典》規定R應大於1.5。
拖尾因子(tailingfactor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)。
《中國藥典》規定T應為0.95~1.05。
T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
流程與儀器
HPLC流程示意圖運行過程：如左圖所示，溶劑貯器（1）中的流動相被泵（2）吸入，經〔3〕梯度控制器按一寫的梯度進行混後然後輸出，經（4）測其壓力和流量，導入（5進樣閥（器）經（6）保護柱、（7）分離柱後到（8）檢測器檢測，由（10）數據處理設備處理數據或（11）記錄儀記錄色譜圖，（12）餾分收集器收集餾分，（13）為廢液。
色譜柱高效液相色譜儀可分為以下幾個部分：
1. 高壓輸液泵：
（1）功能：驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統；
（2）性能要求：流量穩定（±1），耐高壓（30－60Mpa），耐各種流動相：例如：有機溶劑、水和緩衝液；
（3）種類：往復泵和隔膜泵。
2. 色譜柱
（1）功能：分離樣品中的各個物質；
（2）尺寸：10～30cm長，2～5mm內經的內壁拋光的不鏽鋼管柱；
（3）填料粒度：5～10µm，高效微粒固定相；
3. 進樣器
（1）功能：將待分析樣品引入色譜系統；
（2）種類：①注射器，10Mpa以下，1～10µl微量注射器進樣；②停流進樣；③閥進樣，常用、較理想、體積可變，可固定；④自動進樣器，有利於重複操作，實現自動化。
4. 檢測器
（1）功能：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號；
（2）分類：
①示差折光化學檢測器
②紫外吸收檢測器
進樣器③紫外一可同分光光度檢測器
④二極體陣列紫外檢測器
⑤螢光檢測器
⑥電化學檢測器
5. 餾分收集器
（1）功能：如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑑定，或獲取少量試驗樣品的小型製備，餾分收集是必要的；
（2）方法：①手工，少數幾個餾分，手續麻煩，易出差錯。②餾分收集器收集，比較理想，微機控制操作準確。
6. 數據獲取和處理系統
功能：把檢測器檢測到的信號顯示出來。
分類
根據分離原理的不同，可分為：
（一）液－液色譜法（或稱液－液分配色譜法）
流動相和固定相都是液體。試樣溶於流動相後，在色譜柱內經過分界面進入固定液（固定相）中，由於試樣組分在固定相和流動相之間的相對溶解度存在差異，因而溶質在兩相間進行分配。跟氣一液分配色譜有相似之處：分離順序決定於分配係數的大小，分配係數大的組分保留值大。分配係數為溶質在固定相和流動相中的濃度之比。但是氣相色譜法中流動相的性質對分配係數影響大小，而液相色譜中流動相的種類對分配係數卻有較大的影響。
（二）液一固色譜法（或稱吸附色譜法）
流動相為液體，固定相為吸附劑。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。溶質分子被固定相吸附，將取代固定相表面上的溶劑分子。如果溶劑分子吸附性更強，則被吸附的溶質分子將相應地減少。吸附性大的溶質就會最後流出。
液一固色譜適用於分離相對分子質量中等的油溶性樣品，對具有不同官能團的化合物和異構體有較高的選擇性。凡能用薄層色譜成功地進行分離的化合物，亦可用液一固色譜進行分離。缺點是由於非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現象。
（三）離子交換色譜法
離子交換色譜法是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子對交換劑具有不同的親和力而將它們分離的一種方法。
離子交換色譜主要用來分離離子或可離解的化合物，它不僅用於無機離子的分離，例如稀土化合物及各種裂變產物，還用於有機物的分離。20世紀60年代前後，已成功地分離了胺基酸、 核酸、蛋白質等，在生物化學領域得到了廣泛的套用。
〔四）離子對色譜法
離子對色譜法是將一種（或多種）與溶劑分子電荷相反的離子（稱為對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。
離子對色譜，特別是反相離子對色譜解決了以往難分離混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子和非離子的混合物，特別對一些生化樣品如核酸、核苷、兒茶酚胺、生物鹼以及藥物等的分離。另外還可以藉助離子對的生成給樣品引入紫外吸收或發螢光的基團，以提高檢測的靈敏度。
（五）離子色譜法
離子色譜是目前唯一能獲得快速、靈敏、準確和多組分分析效果的方法，因而受廣泛重視並得到迅速的發展。檢測手段已擴展到電導檢測器之外的其它類型的檢測器，如電化學檢測器，紫外光度檢測器等。可分析的離子正在增多，從無機和有機陰離子至金屬陽離子，從有機陽離子到糖類、胺基酸等均可用離子色譜法進行分析。
（六）空間排阻色譜
空間排阻色譜以凝膠為固定相，它的分離機理與其它色譜完全不同。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流體力學體積或分子大小有關。
套用實例
HPLC更適宜於分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛套用於核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。左圖示是其用於有機氯農藥的測定：
高效液相色譜法採用液一固色譜法，固定相：薄殼矽膠CorasilⅡ（37~50μm）；流動相：正己烷；色譜柱：50cm×2.5mm內徑；流速：1.5ml/min；檢測器：示差折光
1－艾氏劑；2－p，p’－DDT；3－p，p’－DDD；4－γ－666；5－恩氏劑。
