雞熱應激與熱應激蛋白的作用機理

1 熱應激和熱應激蛋白的概念
1.1 熱應激的概念
由於外界環境溫度過高，體溫調節及生理機能紊亂而發生的一系列異常反應，並出現生產性能下降，甚至出現休克和死亡等現象叫熱應激。往往蛋雞處於25 ℃以上，肉雞28 ℃以上就會出現熱應激反應。
因為高溫熱應激源的刺激過強、過長或雞體自身對應激源的致敏性增強時，雞的正常生態環境發生改變，正常生理功能與生理狀態發生異常。應激分為警戒期、抵抗期和疲勞期三個階段。警戒期又分為兩類即休克狀態和抗休克狀態。在警戒期的休克狀態時雞體內促腎上腺皮質激素(ACTH)的生成量和釋放量增加，引起腎上腺功能亢進，腎上腺和垂體前葉增生腫大，最終導致腎上腺皮質激素分泌極度減少，此時機體抵抗力降低，若有病原菌侵入，極易發病，甚至死亡。
1.2 熱應激蛋白的概念
從低等動物細菌到高等動物人類，受高溫作用後均可發生熱應激反應，此反應的特點是選擇性合成一組多肽，稱熱應激蛋白(heat stress proteins, HSPs)，又稱熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)、應激蛋白(stress proteins, SPs)，它是一種保護機體的蛋白。
2 熱應激蛋白的類型
熱應激蛋白(HSPs)普遍存在於從細菌到高等真核生物包括人的整個生物界，並且可以被胺基酸類似物、生長因子、重金屬離子、病毒感染等多種因素誘導。熱應激蛋白其實質並不是一個蛋白或一類蛋白而是一個龐大的家族。熱應激蛋白家族是迄今為止發現的最為保守的遺傳系統。根據胺基酸序列的同源性、分子量和功能的不同，HSPs可分為HSP110、HSP90（83～90 kDa）、HSP70（66～78 kDa）、HSP60、HSP40和小分子HSP（15～30 kDa）家族。
每個這樣的HSPs族都由一個或多個不同形式或不同程度修飾的高度同源的蛋白質分子組成。同一族的成員除相對分子量大小相似以外，還具有一些共同的特徵，不同種屬的細胞含有相似的HSPs族，但不同族之間同源性較低。例如，HSP70與HSP90之間幾乎沒有同源性。此外，每一個特定的族在種族發育過程中是高度保守的，如細菌和人類的HSP70分子之間非常相似。在不同生物體中分布於相同細胞器中的熱應激蛋白的相似性通常強於來源於同種生物卻在細胞內*不同的蛋白，這也表明各種HSPs族的功能與其在細胞內的分布有關。
3 熱應激蛋白的特性
3.1 熱應激蛋白基本特點
由於HSPs具有高度應激性和高表達性，提高了機體對應激的抵抗力，從而引發越來越多的學者對HSPs 的研究興趣。HSPs 在進化上具有高度保守性，能與細胞蛋白結合行使功能，故又稱為伴侶分子。總結前人研究成果，熱應激蛋白存在以下特點：①在正常細胞中非應激狀態下水平較低， 而應激狀態下可迅速顯著升高，可達正常水平的數十倍。②正常生理狀態下，HSPs主要存在於細胞質中；應激狀態時HSPs迅速進入細胞核和核仁；應激恢復期，又迅速進入細胞質；當再次應激時，HSPs返回細胞核。③HSPs可被多種刺激誘導而大量產生，具有應激反應普遍性。④HSPs可以提高細胞抗應激能力，其生成量與細胞的耐熱力呈正相關。
HSPs基因除了在一定的真核細胞內表達外，這類基因還能夠被一定的應激原激活，即當機體出現明顯的平衡失調和生理性差異時，且這些差異影響著蛋白質結構的某些方面的功能，例如通過變性，使得胺基酸片段發生轉換或共價修飾，從而獲得應激。
3.2 熱應激蛋白在抗熱應激中熱耐力的特點
熱耐力是指機體對熱作用的耐受能力，預先給生物以非致死性的熱應激,可以加強生物對第二次熱刺激的抵抗力,提高生物對致死性熱刺激的存活率,這種現象稱為熱耐力。在高溫等有害因素作用下，生物機體內出現應激反應，而熱應激蛋白是否能被正常激活，決定了機體熱耐力的形成。主要表現在生物體在接觸亞致死溫度後對致死性高溫產生耐受性，熱耐力提高以後，可以提高機體在致死高溫下的生存能力。
人們通過許多實驗從各個方面證實了HSPs與熱耐力確實有關，表現如下：①當熱應激時，許多生物和細胞的HSP70 可迅速被誘導，而且增加幅度很大。②隨著HSPs表達增強，機體對熱的耐受能力也迅速增強。③給正常細胞轉入HSPs 基因,使其高表達,細胞熱耐力增強。④使一個或幾個編碼HSPs的基因不表達, 細胞抗熱休克能力減弱或消失。有人通過抑制或滅活細胞的基因表達，發現細胞熱耐力降低。也有人用基因敲除（knock out）的方法去除細胞的HSPs基因,得到了相似的結果。⑤不同種屬生物熱耐力的差別與HSPs基因的表達程度密切相關。HSPs可以在機體熱應激時加快正常蛋白質合成的恢復,使熱休克時由於蛋白變性而造成的蛋白質量的減少得到補充,因此使機體獲得熱耐受力。
HSPs賦予細胞或生物從各種應激中恢復的能力,並保護它們免遭應激因素的損害。其中,表現最為明顯的是熱耐受能力的形成,即當細胞或生物接觸非致死溫度後,表現對致死溫度的存活率明顯提高。在熱耐力的形成中,主要是熱應激蛋白HSP70起主要作用。它的編碼基因的5'端含有一段約 14對鹼基的保守序列，對HSP70 mRNA的轉錄具有啟動作用。在熱應激反應時，熱應激蛋白的變化主要取決於轉錄和翻譯上的調節。轉錄水平主要由熱應激轉錄因子（heat shock transcrirtional factors, HSF）調節，它能識別被稱為熱應激元件（heat shock element, HSE）的靶序列。
高溫環境熱應激可誘導幾乎所有組織細胞合成HSP70，其細胞保護作用已基本確認，但HSP70增強熱耐力的作用機制不完全清楚。普遍認為這種廣泛存在、高度保守的HSP70是細胞保護的物質基礎,作為對適應和抵抗熱應激有重要作用的HSP70基因，在不同的地方雞品種中可能存在差異。因此，有必要充分利用我國豐富的家禽基因庫資源，從中尋找雞HSP70基因的多態性，並闡明多態位點在不同雞種中的分布特徵，為研究和利用HSP70基因作為潛在的抗熱性標記輔助選擇的候選基因奠定基礎。
在高溫熱應激源的刺激下，使熱應激蛋白的含量增加的同時應激蛋白也可促使動物體溫升高。據俄國《科學信息》雜誌報導，俄羅斯科學院謝切諾夫生理進化與生物化學研究所和細胞學研究所專家通過實驗證實：在高溫、寒冷和感染等條件刺激下，動物體內的應激蛋白可促使動物體溫升高，以提高機體免疫力。應激蛋白在活體細胞內部合成，可使生物細胞在應激反應中存活下來。俄國研究人員認為，細菌脂多糖是致病微生物細胞膜的一種成分，而應激蛋白既可以通過傳播細菌脂多糖特有的感染信號的方式，又能通過從細胞外部刺激細胞的方式使負責發熱反應的動物下丘腦前端工作起來，提高動物的體溫，激發其免疫系統，從而提高機體的免疫能力。　
4 熱應激蛋白的功能
HSPs幾乎存在於所有生物體內的各種細胞中，當細胞受到損傷時，均伴隨著HSPs含量的增加，大量的資料表明，HSPs在熱耐力形成過程中維持細胞內環境的穩定具有重要作用。一些資料表明熱耐力與HSPs的表達呈正相關，因此現在普遍認為HSPs的功能主要在於穩定細胞的結構，使細胞維持正常的生理功能。熱應激蛋白在細胞生長、發育、分化、基因轉錄，蛋白質的合成、摺疊、運輸、分解及其膜和細胞骨架的形成等多方面發揮著重要的作用。
4.1 HSP70家族的主要功能
HSP70家族包括分子量為72、73、75、78 kDa等的蛋白質，是HSPs家族中最豐富的一種，HSP70可參與蛋白質的代謝。高溫熱應激時,雞體為了適應環境,各臟器組織充分發揮自我生理調節作用可誘導雞大腦、肝臟、肺、心臟等組織中HSP70的產生增加。HSP70、HSP70 mRNA在各臟器組織中的表達水平各異。HSP70主要在心、肝組織中大量表達,且與肛溫變化一致，可能是因體溫升高，誘發熱應激基因開放。Gabrief等在對肉雞的熱應激中發現HSP70 mRNA量在35 ℃、3 h達到最高值，這說明HSP70 mRNA受熱誘導的增加具有時間依賴性。若應激過強或時間過長，HSPs在應激中表達量降低，導致細胞和機體嚴重受損。隨著HSPs的增多,細胞存活率增高、受損輕,特別是熱適應後細胞損傷更輕,顯示出HSP70對細胞的保護作用。因此常把HSPs作為細胞損傷的一個客觀指標和熱應激的敏感指標。
4.2 HSPs其它家族的功能
近年來研究證實HSP60在自身免疫性疾病、傳染病、慢性感染的發病中均發揮重要作用。HSP90在細胞內具有重要的生理功能，HSP90在組織細胞內有很高的基因表達，參與細胞周期調控，還參與免疫和免疫調節作用 。禽類HSP108最早發現於1981年，其主要功能是作為蛋白受體，具有免疫原性。由於應激反應的普遍性及HSPs高表達提高了機體對應激的抵抗力。
5 熱應激蛋白在熱應激中的作用機理
李培慶等套用3H-Dex放射配體結合的Scatchard分析和35S-蛋氨酸體外標記法分別測定了環境溫度40 ℃熱應激時，雞外周血淋巴細胞(PBL)的糖皮質激素受體(GR)的最大結合容量(Ro)、平衡解離常數(Kd)及其熱休克蛋白的表達，結果顯示在熱應激處理後0.5～4 h雞細胞熱休克蛋白(HSPs)的合成持續增加，在熱應激最初0.5 h細胞總的蛋白合成迅速下降而HSPs合成增加，主要有HSP100、HSP90、HSP70和HSP25。在這些HSPs 4 h內合成增加的過程中，糖皮質激素受體（GR）含量迅速下降，細胞總的蛋白的合成也逐漸恢復。這可能由於HSPs廣泛地參與到細胞骨架和核骨架的形成中，與細胞的功能有著密切的聯繫。因為核仁對熱特別敏感，因此可以推測在熱應激早期由於細胞核的受損從而使蛋白質合成的mRNA轉錄受阻，而抑制了蛋白質的合成。HSPs在熱應激過程中對細胞結構和機能的重建，維持激素與糖皮質激素受體（GR）的親合力，穩定受體蛋白結構，提高機體熱耐受力具有重要意義。
Welch和Suhan在觀察應激及應激恢復期哺乳動物細胞時發現經熱休克的細胞，許多核蛋白變為不可溶並成為基質的一部分。在應激過程中合成的HSP70可向細胞核遷移並以親水的方式結合到基質上，然後再集中到細胞核里，加速熱休克的核仁恢復正常，修復被損傷的前核糖體。HSP25等小分子HSPs在熱耐受方面尤為重要，它們在結構上具有較高的保守性，可以形成緊密的聚合結構——熱休克顆粒。有實驗證明，抑制小分子HSPs(22~32 kDa)產生，能夠導致細胞熱保護性喪失。另外，小分子HSPs還能參與聚合蛋白質的解聚和異常蛋白質的降解。因此，熱休克過程中HSPs合成增加可增強細胞的熱耐受力，促進和提高細胞從應激狀態中恢復正常功能。熱應激時誘導產生的大量的HSPs可能參與調節維持激素與受體的親合力，穩定受體構象，以保證有效的受體數量，來發揮其生物學效應。
HSPs的合成可能參與穩定細胞內包括受體蛋白在內的其它蛋白的結構形成，促進變性蛋白的復原，對損傷的組織細胞有減輕再損傷的作用。因此，糖皮質激素（GC）、糖皮質激素受體（GR）及HSPs的綜合調節對特殊環境下生物體的適應性生存具有重要意義。