限制性酶切片段差異顯示(RFDD-PCR)

技術介紹

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RFDD-PCR不是直接擴增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切後的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進行擴增。

技術分析

正是RFDD-PCR系統使用了一系列特殊接頭和引物，特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應使RFDD-PCR分析具有高度的重複性，解決了第一代差別顯示系統的重複性問題；因為RFDD-PCR技術不使用以poly(A)為引物的PCR擴增，因而該系統對原核和真核系統皆適用；在第一代的差異顯示系統中，下游引物特異性結合poly(A)尾，因此與3'端未翻譯區域相對應的差異表達序列大部分被鑑別出，而RFDD-PCR 採用優先切割翻譯序列的限制性內切酶（如TaqI），因此可以優先展示編碼區，更加適合於下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差異顯示基因後，與disploy Fit網路相連後，可以確定哪個基因是已經研究過的，哪些是未知基因，對下一步研究有很好的知道意義。總之，RFDD-PCR中高度嚴謹的PCR可以產生結果一致的基因表達圖譜，重點放大和展示編碼區，對原核及真核RNA都有用，大大消除假陽性。