簡介
設計多循環反應的程式,以使相連循環的退火溫度越來越低。由於開始時的退火溫度選擇為高於估計的Tm值,隨著循環的進行,退火溫度逐漸降到Tm值,並最終低於這個水平,用於確保第一個引物—模板雜交事件發生在最互補的反應物之間,即那些產生目的擴增產物的反應物之間。儘管退火溫度最終會降到非特異雜交的Tm值,但此時目的擴增產物已開始幾何擴增,在剩下的循環中處於超過任何滯後(非特異)PCR產物的地位。
由於目標是在較早的循環中避免低Tm值配對,在TD—PCR中最好套用熱啟動技術。設計時,退火溫度的範圍應跨越15℃左右,從高於估計Tm值至少幾度到低於它10℃。
其他特性
例:一對沒有簡併的引物—模板的計算Tm值為62℃。
則:從65℃—>50℃(每2cycles降退火溫度1℃),再在50℃退火溫度下做15個循環。
實驗中如持續出現假象帶(雜帶),則是因為起始退火溫度太低,或目的擴增產物和非目的產物的Tm值相差無幾,或非目的擴增物以更高的擴增效率擴增,可把退火溫度每降低1℃所需的循環數增加到3或4。