使用簡併引物即可以進行“Touchdown PCR”。由這種方法將獲得大量的產物,但因為由肽序列可以知道引物之間的確切距離,所以可以根據產物的大小來選擇所需要的產物。該方法的優點在於可以富集引物與模板正確配對的產物。如果克隆和測序一打PCR產物,將可以確定肽的正確編碼序列,設計進行雜交的寡核苷酸等。該技術特別適用於由Ser,Lys和Arg(每個有6個密碼子)構成的多肽。用primer premier來計算引物Tm值,退火溫度設計為從Tm+5度降落至Tm-10度,每度2個cycle,最後在tm-10度上增加5-10個cycle.例:Tm為58度,則從63度降落到48度,每度2個cycles,最後在48度加5-10個cycles.
原理就在於,溫度的升高提高了PCR擴增的特異性,但也提高了引物結合的難度,降低了擴增的效率,因此一開始先用高溫擴增,保證擴增的嚴謹性,待目的基因的豐度上升後,降低擴增的溫度,提高擴增的效率(此時非特異的位點由於豐度低,無法和特異位點競爭)。
但是,退火溫度TOUCH DOWN無法改善擴增效率低的問題,一般用於在雜模板中提高擴增特異性。
降落PCR(touch down PCR):指的是每一個(或n個)循環退火溫度逐步降低1度,直到達到一個較低的退火溫度,該溫度稱為:“touchdown"退火溫度,然後在該溫度下繼續循環10個左右循環。
退火溫度的起始溫度高於計算的Tm15度左右,在接下來的循環中,退火溫度每個循環降低1-2度(一般為1度),直到低於Tm5度。
該策略的目的在於確保第一個引物-模板雜交事件發生在最互補的反應物之間,即特異性擴增的反應物之間,當退火溫度降低到非特異性擴增發生的水平時,特異產物在此時已經有一個幾何數的起始優勢,在剩餘的反應中,特異產物會競爭非特異產物,特異產物始終優先擴增,從而產生單一的占主導地位的擴增產物。
該方法主要用於避免非特異性PCR產物的出現,尤其是當使用複雜的基因組DNA模板,非特異性退火易發生時。
例子:
94度預變性3分鐘,
94度變性30秒,65度(Tm若為55度)退火30秒,72度延伸1分鐘。
以後每個循環依次降低1度,直到50度,共15個循環。
94度變性30秒,50度退火30秒,72度延伸1分鐘。15-20個循環。
72度延伸10分鐘。