重組質粒的構建及序列分析
關鍵字：單純皰疹病毒 胸苷激酶基因 缺失突變 序列分析
摘 要：目的：構建HSV-1型胸苷激酶基因部分缺失的重組質粒並進行序列測定。方法：以pUC18/TK重組質粒DNA為模板，用PCR方法擴增TK5′端503bp基因片段，並將擴增的片段克隆入載體pUC18中(pUC18/TK1)；用PstI和HindⅢ雙酶切pUC18/TK，獲得TK3′端383bp片段，將此酶切片段克隆入pUC18/TK1中，並進行測序。結果：構建成重組質粒pUC18/TK－。經酶切鑑定獲得1條約900bp的基因片段；序列測定證實,HSV-117syn＋TK基因缺失了第493～744位251對鹼基。結論：成功地構建了部分缺失的HSV-1/TK－基因重組質粒，為研製其突變株奠定了基礎。
中國圖書資料分類號：Q78R373.11
Constructionandseguencingrecombinatplasmidofthethymidine
kinasegenedeletionmutationofherpessmplexvirustypeI
ZhenRongfen,YuQigui,ChenWei，FanRong,XueCaifang
(LaboratoryofAntiinfectiousDiseases,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032)
Keywords：herpessimplexvirusthymidinekinasedeletionmutationseguencingmutation
Abstract：Aim:ConstructingandseguencingrecombinatedplasmidofthethymidinekinasegenedeletionmutationofherpessmplexvirustypeI(HSV-1).Methods:The5′-TK503bpwasamplifiedbyPCR.AndtheTKgenicDNAofHSV-117syn＋strainintherecombinatedplasmidpUC18(pUC18/TK)wasusedastamplate.TheamplifiedfragmentwasclonedintopUC18vector（pUC18/TK1）.ThenthepUC18/TKwascleavedwithbothpstIandHindIIIenzymes.The3′-TK383bpfragmentwasobtainedandclonedintoplasmidpUC18/TK1.It'ssequencewasanalysed.Results:TherecombinationplasmidpUC18/TK－wasconstructed.The251bpfromlocation493to744ofTKgeneofHSV-117syn＋strainwasdeletedintheplasmidpUC18/TK－.Theotherpartofthesequencedidnotvary.Conclusion:TherecombinatedplasmidofHSV-1/TK－inwhichpartgenomewasdelectedwassuccessfullyconstructed.TheplasmidpUC18/TK－laidagoodfundationforfurtherconstructingTKdeletionmutantofHSV-1.
單純皰疹病毒I型（herpessimplexvirustypeI,HSV-I）的胸苷激酶(thymidinekinase,TK)基因為其早期基因,若發生突變則形成突變株[tk(－)HSV-I],能在鼠三叉神經節細胞等非分裂細胞中建立潛伏感染，但不能激活[1]，故對正常神經細胞無破壞作用。但tk(－)HSV-I能感染分裂細胞(如神經膠質瘤細胞和視網膜瘤細胞等)，並能在這些細胞中增殖，使之溶解破壞[2]。體外研究表明，tk(－)HSV-I突變株可殺傷U87和L19等神經膠質瘤細胞[3,4]。經皮下、腎包膜下及顱內右前葉直接注射tk(－)HSV-I突變株於荷神經膠質瘤的裸鼠及具有免疫活性的大鼠體內，可使腫瘤組織發生壞死，但不破壞正常組織。因此,本研究擬構建部分缺失的HSV-1/TK－基因重組質粒,以為進一步構建TK基因部分缺失的重組HSV-1突變株奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 質粒 重組質粒pUC18/TK(含HSV-117syn＋株TK基因的全部編碼區序列),由本室構建[5]。
1.2 引物 通過計算機輔助分析，根據HSV-117syn＋TK基因序列，在其5′端設計一段引物（引物1），引入EcoRI酶切位點；根據HSV-117syn＋TK基因第468～492位鹼基序列，設計一段反向引物（引物2）,並引入PstI酶切位點。引物由美國OperonTechnologies公司合成。其序列如：引物1:For:5′-CGGAATTCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCA-3′引物2:Rev:5′-TACTGCAGATGGCGGTCGAAGATGAGGGTGA-3′
1.3 質粒的提取、酶切、連線及轉錄 主要方法均參照《分子克隆》一書進行。
1.4 HSV-117syn＋TK基因部分序列（503bp）重組質粒的構建 PCR反應體系：模板為本室構建的重組質粒pUC18/TK600ng,引物1For和引物2Rev各1μmol/L，4種dNTP各200μmol/L，3mmol/LMgCl2,5μl10×PCR緩衝液，總體積50μ1。PCR反應液經100℃煮沸變性5min後，每管加入Taq聚合酶0.8U,以20μ1液體石蠟油封面後，進行PCR擴增：即94℃1min,60℃1min,72℃延伸90s,共35個循環。然後於72℃延伸10min。PCR產物在含0.5mg/L溴化乙錠(EB)的10g/L瓊脂糖凝膠中電泳,在紫外燈下觀察結果。經10g/L低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收503bp片段。用SurePureDNAExtractionKit(EmbiTec公司產品)純化回收的DNA片段。經EcoRI和PstI雙酶切後,克隆入經相應酶切後製備的pUC18載體中,轉化感受態JM109細菌。將得到的陽性克隆，經PCR及EcoRI和PstI雙酶切鑑定，命名為pUC18/TK1重組質粒。
1.5 HSV-1TK基因部分缺失重組質粒的構建 用PstI和HindIII雙酶切pUC18/TK重組質粒，回收TK3′端383bp的片段；克隆入用同種酶切消化的pUC18/TK1中，轉化感受態JM109細菌，將得到的陽性克隆，經PCR及EcoRI和HindIII雙酶切鑑定，命名為pUC18/TK－重組質粒（圖1）。
相關詞條
參考連結
1、http://www.helixnet.cn/archiver/tid-2721.html
2、http://scitech.people.com.cn/GB/other2137/
3、http://book.sina.com.cn/nzt/spi/gongzuodna/
