甲硫氨酸醯肼
1.[生物化學]甲硫氨酸醯肼
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蛋白質一級結構的測定方法
研究蛋白質的一級結構從確定組成蛋白質的單元結構棗胺基酸算起，已有150年的悠久歷史，直到1955年，Sanger首次闡明胰島素的胺基酸排列順序，為研究蛋白質的一級結構開闢了道路。這在分子生物學的發展進程中是一個重要突破。目前關於核酸的一級結構研究，由於Sanger等發明了加減法，可以得到了突飛猛進的發展。對此之下，關於蛋白質的一級結構研究進展不如核酸迅速。但隨著Edman液相自動順序分析儀和固相順序分析儀以及氣相色譜質譜(GCMS)等方法的相繼出現。使結構分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種蛋白質的一級結構分析。目前不僅樣品用量減少，而且工作人員也大大減少。當年Sanger分析胰島素用了整整十年的時間，今天運用自動化儀器，分析一個分子量在10萬左右的蛋白質只需要幾天，可見新技術的套用和發展對科學發展起的促進作用，蛋白質一級結構測定方法的綜述及專著文獻較多，這裡只扼要加以概述。
蛋白質分子的一級結構測定，概括起來包含多肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及－S－S－定位等。
一級結構的測定方法可概述如下：
1.多肽鏈的分離
在測定一個蛋白質的結構以前，首先必須保證被測蛋白質的純度，使結果準確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數，按照其亞基數將蛋白質分成幾個多肽鏈。
1)肽鏈的拆開
蛋白質分子多肽鏈的連線有共價結合和非共價結合兩種。要拆開以共價結合的-S-S-連線的多肽鏈，必須採用的化學處理方法常有：
①過甲酸氧化
用氧化劑過甲酸斷裂-S-S-。這個反應一般在0℃下進行2小時左右，兩個S就全部能轉變成磺酸基，這樣被氧化的半胱氨酸稱為磺基丙氨酸。
如果蛋白質分子中同時存在半胱胺酸，那么也會被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，從而增加分析的複雜性。
②巰基乙醇還原
利用還原劑巰基乙醇亦可使蛋白質的-S-S-斷裂。當高濃度的巰基乙醇在pH8?條件下室溫保溫幾小時後，可以使-S-S-定量還原為桽H。與此同時反應系統中還需要有8摩爾脲或6摩爾鹽酸胍使蛋白質變性，多肽鏈鬆散成為無規則的構型，此時還原劑就可作用於-S-S-。此反應是可逆的，因此要使反應完全，疏基乙醇的濃度必需在0.1-0.5摩爾。
③Cleland試劑的還原作用
Cleland′s指出二硫赤蘇糖醇(dithioerythriotol)及二硫蘇糖醇(dithiothriotol)在氧化還原能力上是比較強的試劑，只要0.01摩爾就能使蛋白質的-S-S-還原，反應基本與疏基乙醇相似，且在許多球蛋白反應中，可以不用變性劑。
Cleland試劑首先與蛋白質-S-S-形成中間物，反應終了，還原劑被氧化形成一個穩定的六環化合物，蛋白質則被還原。
還原蛋白不穩定，SH基極易氧化重新生成-S-S-鍵。穩定SH基的方法有：
(A)烷基化試劑使SH基轉變為穩定的硫醚衍生物。
如果碘代乙醯胺代替碘代乙酸，其產物S羧氨甲基衍生物不帶電荷，磺代乙酸也可與組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸發生反應，但反應條件不同，可通過各種pH及反應時間進行控制。
(B)氨乙基化
蛋白質分子的幾條肽鏈若以非共價健結合，則用尿素、鹽酸胍等變性劑即可拆開。蛋白質的多肽鏈被拆開後，將它分離純化，一般多用凝膠過濾、離子交換、電泳等方法，茲不贅述。
分離純化後的每條肽鏈還要進一步分析其末端。
2)末端分析 其方法較多，這裡我們只介紹較常用的幾種。
(1)N-末端測定
A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻之一。
DNP-胺基酸用有機溶劑抽提後，通過層析位置可鑑定它是何種胺基酸。Sanger用此方法測定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。
B.氰酸鹽法：1963年stank及Smyth介紹了一種測定N末端的新方法，步驟如下：
由於乙內醯脲胺基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法將它與游離胺基酸分開，分離所得的乙內醯脲胺基酸再被鹽酸水解，重新生成游離的胺基酸，鑑別此胺基酸即可了解N-末端是何種胺基酸。
C.二甲基氨基萘磺醯氯法：1956年Hartley等報告了一種測定N-末端的靈敏方法，採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯，簡稱丹磺醯氯。它與游離氨基末端作用，方法類似於Sanger的DNFB法，產物是磺醯胺衍生物。
丹磺醯鏈酸具有強烈的黃色螢光。此法優點為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍，樣品量小於1毫微克分子)及丹磺醯胺基酸穩定性較高(對酸水解穩定性較DNP胺基酸高)，可用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑑定。
(2)C-末端分析
A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法。將多肽溶於無水肼中，100℃下進行反應，結果羧基末端胺基酸以游離胺基酸狀釋放，而其餘肽鏈部分與肼生成胺基酸肼。
這樣羧基末端胺基酸可以採用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進行分析。如果羧基末端胺基酸側鏈是帶有醯胺如天冬醯胺和谷氨醯胺，則肼解時不能產生游離的羧基末端胺基酸。此外肼解時注意避免任何少量的水解，以免釋出的胺基酸混淆末端分析。
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端胺基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶A、B和C。套用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的胺基酸主要是C末端胺基酸。
3)氨基
