實罐滅菌

實罐滅菌

實罐滅菌是指將配製好的培養基放入發酵罐或其他裝置中,通入蒸汽將培養基和所用設備加熱至滅菌溫度後維持一定時間,再冷卻到接種溫度,也叫間歇滅菌、分批滅菌。實罐滅菌無需專門的滅菌設備,滅菌效果可靠,對滅菌用蒸汽要求低(0.2~0.3MPa)。但同時,實罐滅菌溫度低、時間長而對培養基成份破壞較大,在工業生產中難以實現自動控制。實罐滅菌是中小型發酵罐常採用的一種培養基滅菌方法 。

原理

在進行培養基滅菌之前,通常先把發酵罐空氣分過濾器滅菌並用空氣吹乾。進料後,開動攪拌以防止沉澱。然後開啟夾套蒸汽閥,緩慢引進蒸汽,使料液升溫至80℃左右後關閉夾套蒸汽閥門。開三路(空氣、出料、取樣)進汽閥,開排汽閥。當溫度升到110℃時,控制進出汽閥門直至121℃(表壓0.1~0.15MPa) ,開始保溫,一般保溫20min。保溫結束後,關閉過濾器排汽閥、進汽閥。關閉夾套下水道閥,開啟冷卻水進回水閥。待罐壓低於過濾器壓力時,開啟空氣進氣閥引入無菌空氣。隨後引入冷卻水,將培養基溫度降至培養溫度 。

要點掌握

實罐滅菌時一般應掌握如下幾點:

(1)蒸汽進入夾層或蛇形管預熱時,應同時打開排氣口,充分排出罐內空氣。

(2)滅菌過程進入罐內蒸氣量要大,儘可能採用三路蒸氣直接進內層。

操作方法

首先確認蒸汽發生器的各開關都處於正常狀態,向發酵罐內加入水,將蒸汽發生器打開,然後檢查發酵罐的各個開關是否都處於關閉狀態。清洗罐內,用自來水沖洗,並且取下pH電極,pH電極使用前要進行校正,校正用兩種標準溶液,一種pH為4,另一種pH為6.86,校正方法與一般電極相同,校正完成後插上電極。確認排料口已經關閉,向罐內注入6L的LB培養基,培養基的配方與種子培養時的培養基配方相同,然後旋緊加料口蓋,打開攪拌,攪拌速度為200rpm。打開蒸汽發生器的蒸汽輸出閥門,打開發酵罐的蒸汽通路總閥和排料口的蒸汽閥,排儘管路中殘存的冷凝水,等出料口只有水蒸汽冒出時,就說明冷凝水排盡,此時關閉排料口的蒸汽閥門,打開通入夾套中的蒸汽閥門,與排污閥,控制夾套中的壓力,使其處於1.5MPa到2.0MPa左右,罐內的溫度會迅速上升,等溫度達到95℃時就可以關閉攪拌了,此時罐內的培養基已經沸騰無需攪拌,混合的效果已經很好,同時要開始控制罐頂端的排氣閥,先全開,以排盡罐內的空氣,然後適當關小此閥,使罐內的壓力略大於大氣壓。當溫度達到121℃時,實罐滅菌開始計時,同時控制罐壓和夾套內的壓力,溫度才能維持在121℃。

計時開始十分鐘後,打開空氣過濾器的蒸汽閥門和隔膜閥,對空氣通路滅菌。在維持121℃結束前,校正溶氧電極,設定為亞硫酸鈉,即溶氧為設定為0。計時結束後關閉所有的蒸汽閥門,向夾套中通入自來水,此時排污閥仍需要適當打開,因為罐內培養基會使冷卻水氣化,此時要吹乾空氣過濾器內的濾棉,當罐內的溫度降到95℃時,打開攪拌,轉速設定在200rpm,關閉排污閥和排氣閥,向罐內通入無菌空氣,當罐壓上升後,打開排氣閥。當罐內的溫度下降到40℃時,啟動控溫程式,關閉一個水閥,使水流經控制器後在進入夾套。此時可以校正溶氧電極,設定為空氣,即溶氧設定為100 。

優點

1、設備成本低;

2、染菌風險低,連續滅菌過程需要將滅菌發酵液無菌輸送至無菌發酵罐;

3、易於人工控制;

4、易於處理含有高比例固體物質的培養基。

5、滅菌用蒸汽要求低(0.2~0.3MPa)。

缺點

1、滅菌溫度低、時間長而對於培養基的營養成份破壞大;

2、蒸氣用量波動大。

3、工業生產中難以實現自動控制。

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