反相離子對色譜法
（ion pairreversed phase chromatography )
反相離子對色譜法的套用
反相離子對色譜法測定魚腥草素鈉的含量
儀器與試藥
1．1 儀器 美國HPll00高效液相色譜儀，VWD紫外一可見光檢測器，HPl 100化學工作站，Rheodyne手動進樣器，日本島津UV-265FW自動記錄分光光度計，SB3200超音波清洗器。
1．2 試劑 乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、醋酸、醋酸銨、四丁基氫氧化銨、四丁基溴化銨均為分析純，超純水。
1．3 對照品與樣品 魚腥草素鈉對照品(中國藥品生物製品檢定所，批號為：0247-9601)；魚腥草素鈉原料(上海漢殷藥業有限公司，批號為：990701，010301，030101，030301、040101)
2 測定方法與結果
2．1 色譜條件
色譜柱：Zorbax Cs 5μm，150 mn×4。6 mm；流動相：2mmol/L四丁基氫氧化銨溶液．乙腈(64：36)；流速：1。0mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫為室溫；進樣量為20 μL。
2.2 色譜條件選擇
2．2．1 檢測波長及溶劑選擇 取魚腥草素鈉對照品，用流動相超聲溶解並製成約8μg/mL的溶液，進行紫外掃描。魚腥草素鈉能完全溶解並在283 nm處有最大吸收，故以此波長為檢測波長，流動相為溶劑。
2．2．2 柱溫選擇 取同一樣品溶液，於同日分別在室溫(22℃)、柱溫為42℃下各進樣兩針，結果魚腥草素鈉的理論塔板數依次為8 898、8 900、8 899、8 899，RSD為O．1%；峰面積依次為168 685、167 633、164 638、167 185，RSD為1．0%。說明柱效幾乎不變，柱溫對檢測無影響，為避免加溫對色譜柱的損害，所以採用室溫作柱溫。
2。3 供試品溶液的製備
取乾燥至恆重的魚腥草素鈉適量，精密稱定，加流動相超聲溶解並稀釋成含魚腥草素鈉約為24 μg/mL的溶液，搖勻，即得。另取魚腥草素鈉對照品，同法製備對照品溶液。
2．4 方法學驗證
2．4．1 線性關係考察 取魚腥草素鈉對照品，用流動相溶解並稀釋製成每1 mL含魚腥草素鈉O．080 1 mg的溶液，即為儲備液，精密取儲備液o．5，1.0，1．5，2．0，3.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻即得。吸取上述儲備液及稀釋溶液各20μL注入液相色譜儀，依法測定，每個濃度重複進樣2次，記錄峰面積。分別以濃度C為橫坐標，峰面積A的平均值為縱坐標，求得魚腥草素鈉的線性回歸方程：A=1．289 5×10-2C+1．634 2×10-4，r=O。999 9；線性範圍為：80．1—1 602μg/mL。
2．4．2 精密度試驗 精密吸取魚腥草素鈉對照品溶液，注入液相色譜儀，記錄峰面積，RSD值為1．O%(幾=6)。
2．4．3 穩定性試驗 取同一樣品溶液於o，6，20，36，42，66h測定，記錄峰面積，魚腥草素鈉峰面積6次測定值的RSD為0．9%，表明樣品溶液在66 h內穩定。
2.4．4 重複性試驗 取同一批樣品(030301)3份，依法測
定，平均含量為100。6%，RSD為1．3%。
2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品5份，遞增添加魚腥草素鈉對照品溶液適量，依法製備和測定。魚腥草素鈉的平均回收率為99．6%，其RSD為1．0%。結果見表1。
3 樣品測定
取魚腥草素鈉原料5批，依法製備供試品溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液進樣，用面積外標法計算，並用碘量法測定進行比對，結果見表2。
4 討論
4.1 檢測方法的選擇 魚腥草素鈉易溶於熱水，在水或乙醇中微溶，極性與對乙醯氨基酚相似，用其滴劑的反相檢測方法，以C18(5 I．Lm，4．6mm×150mill)為固定相，不同比例的甲醇．醋酸與醋酸銨緩衝液(pH6。o)為流動相檢測，均無峰檢出。再將流動相改為不同配比的磷酸．水．甲醇，三乙胺．水．甲醇試驗，仍未果。
參考了青黴素的反相離子對色譜法檢測後，採用反相離子對色譜法，用短鏈固定相，C8(5 I．Lm，4．6 mm×150 mm)色譜柱，在流動相中加入反離子試劑四丁基溴化銨，有峰檢出，但分離效果差；改加四丁基氫氧化銨，以2 mmol/L四丁基氫氧化銨溶液．甲醇(31：69)為流動相試驗，峰型有改善，可保留時間很短(約3。5 min)，見圖工(A)。將甲醇改為乙腈試驗，效果良好，見圖1(B)。試驗了不同配比，最終以2 mmol/L四丁基氫氧化銨溶液．乙腈(64：36)為流動相，效果最好。
4．2 反離子試劑的用量與流動相的pH 流動相中反離子試劑四丁基氫氧化銨的用量應控制在1．6—2．2 mol/L。用量低於1．6 mol/L，由於親和力太低，起不到反離子效果；用量超過2．2 mol/L時，pH值過大，達9。O以上，易損壞色譜柱。經試驗，四丁基氫氧化銨的用量在2．0 mmol/L時，pH值為7．2，效果最好。
反相離子對色譜法測定馬來酸噻嗎洛爾
1 儀器、藥品與試劑
島津LC-10AD泵，SPD-10A紫外檢測器，CTO-10A柱溫箱，C-R6A數據處理機。
馬來酸噻嗎洛爾(天津中央製藥廠)，馬來酸噻嗎洛爾滴眼液(天津市售產品)，輔料及中間產物(天津中央製藥廠)。
乙腈(色譜純)，磷酸二氫鈉(化學純)，辛烷磺酸鈉(山東禹王實業總公司化學試劑廠)。
2 色譜條件
色譜柱：YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相：0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩衝液[取磷酸二氫鈉1.56 g，加水1000 mL,用磷酸(1→10)調節pH至3.50±0.05，加入辛烷磺酸鈉0.65 g使溶解，搖勻]-乙腈(70∶30)；流速：0.7 mL·min;檢測波長：297 nm；積分儀衰減：0；紙速：1.5 mm·min；靈敏度：0.05 AUFS；柱溫：40 ℃，理論板數不低於2 000。
3 實驗方法
3.1 色譜條件的選擇 經過對不同磷酸鹽、不同濃度(0.02，0.01，0.005 mol·L)緩衝溶液與甲醇或乙腈以不同配比(65∶35，70∶30，75∶25)篩選，並對加入不同離子對試劑(己烷磺酸鈉及辛烷磺酸鈉)，比較其不同濃度(0.085%，0.065%，0.045%)，不同pH條件(pH=3.0,pH=3.5)。最終選擇0.01 mol·L磷酸二氫鈉緩衝液[用磷酸(1→10)調pH=3.5]配製的0.065%辛烷磺酸鈉溶液與乙腈(70∶30)組成的流動相為最佳條件(圖1)。另以流動相溶解原料作紫外掃描，最大吸收297 nm為檢測波長。
3.2 線性實驗 精密取馬來酸噻嗎洛爾適量(約相當於噻嗎洛爾12.5 mg)置200 mL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度。分別精密取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置25 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，進樣20 μL,以濃度(μg·mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得到噻嗎洛爾的回歸方程：
Y=875.19X-137.05 r=0.999 3
結果表明濃度在3.0～11.2 μg·mL範圍內，線性關係良好。
3.3 有關影響因素實驗 取生產廠提供的馬來酸噻嗎洛爾中間體噻二唑、唑烷進行實驗，均對主峰無影響(圖2)。另按滴眼液處方配製空白輔料溶液，在規定的色譜條件下，基本為一直線，對本實驗也無干擾。
3.4 精密度實驗 精密稱取馬來酸噻嗎洛爾(980102批)適量(約相當於噻嗎洛爾12.5 mg)，置25 mL量瓶中，用流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，重複進樣6次，噻嗎洛爾RSD=0.35%,馬來酸RSD=0.44%，有較好的精密度。
3.5 加速實驗 將原料藥980102批及滴眼液980502光照27 d後，實驗結果見表1。原料藥經光照後比較穩定，色譜圖無變化，滴眼液色譜圖有明顯改變(圖3)，雜質峰增多，含量下降。本實驗說明，該方法能夠反映出樣品的變化，可以控制產品質量。
4 樣品測定4.1 原料藥 取本品(約相當於噻嗎洛爾12.5 mg)，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動相使溶解並稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為記錄儀滿量程的10%～20%，再取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍(主成分保留時間應在10 min後)，除馬來酸峰之外，供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰，量取各雜質峰面積的和不得大於對照溶液的峰面積。結果見表3。
4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL(約相當於噻嗎洛爾5 mg)置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度作為對照溶液，照上述方法檢查，應符合規定。
5 討論5.1 實驗中流動相比例的調整，以主峰保留時間在10 min之後為宜，馬來酸峰與相鄰雜質峰基線分離較好。
5.2 方法中規定記錄色譜圖為主峰保留時間的3倍，是由於原料藥中間體噻二唑的保留時間約為26 min，實驗中970601批滴眼液中檢出該雜峰。
5.3 本實驗供試液自然放置24 h後複測，溶液濃度不變，雜質量不增加，比較穩定。
