遺傳物質
![半保留複製](/img/0/fe4/nBnauM3XyYDOzMjM0YjMycTNyITMxEDM3QjMwADMwAzMxAzL2IzL1YzLt92YucmbvRWdo5Cd0FmL0E2LvoDc0RHa.jpg)
DNA在活體內的半保留複製特徵已為1958年以來的大量試驗所證實。DNA的這種複製方式對保持生物遺傳的穩定具有非常重要的作用。還可能存在其他兩種複製方式,都以原來親本DNA雙鏈分子作為模板鏈。一種方法稱為全保留複製(conservativereplication),在複製過程中新的DNA分子單鏈結合在一起,形成一條新的DNA雙鏈,而親本DNA雙鏈仍然被保留在一起。另一種方法稱為散布式複製(dispersivereplication),在複製過程中親本DNA雙鏈被切割成小片段,分散在新合成的兩條DNA雙鏈分子中。
1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick在提出DNA雙螺鏇結構時,對其互補關係予以很大的重視,而且提出了DNA的複製模型。DNA在進行複製時各以雙鏈中的每一條鏈作為模板,各個和互補的前體單核苷酸配對重合而形成與這二條單鏈各各對應的雙重子螺鏇二條。所謂互補就是指腺嘌呤一定只與胸腺嘧啶配對,鳥嘌呤一定只與胞嘧啶配對,新的單核苷酸排列在模板上時,其排列法是依原來鏈上的鹼基通過互補來決定的。這樣無論子分子與子分子間,還是子分子與母分子間,鹼基排列順序是完全相同。這樣一來具有和親本完全一樣的遺傳信息的子分子自我增殖了二倍。這時所產生的子雙重螺鏇分子一條鏈是從親代原封不動的接受下來的,只有相對的一條鏈是新合成的,所以把這種複製方式稱作半保留複製。這個模型曾用重同位素標記的DNA以密度梯度離心法進行分析,或用放射性同位素標記的DNA以放射自顯影法進行測定等等,用幾種不同原理的方法,曾在從人到病毒的許多種生物中進行了驗證,肯定了這個模型的正確性和普遍性。關於DNA是以半保留方式複製這一點已被認為是生物學中最基本的肯定性原理。
Watson和Crick在提出DNA雙螺鏇結構模型時即推測,DNA在複製時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開,然後以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈,這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA,另一條鏈是新合成的,這種複製方式為半保留複製(semiconservativereplication)。
1958年Meselson和Stahl利用氮標記技術在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留複製,他們將大腸桿菌放在含有15N標記的NH4Cl培養基中繁殖了15代,使所有的大腸桿菌DNA被15N所標記,可以得到15N樳NA。然後將細菌轉移到含有14N標記的NH4Cl培養基中進行培養,在培養不同代數時,收集細菌,裂介細胞,用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法觀察DNA所處的位置。由於15N樳NA的密度比普通DNA(14N-DNA)的密度大,在氯化銫密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)時,兩種密度不同。
物理實驗
![半保留複製](/img/7/645/nBnauM3X0EDNykDN2YjMycTNyITMxEDM3QjMwADMwAzMxAzL2IzLwIzLt92YucmbvRWdo5Cd0FmLyE2LvoDc0RHa.jpg)
DNA帶的密度應當介於兩者之間,也就是相當於一根鏈是14N,另一根鏈是15N。而經歷過大約兩次複製後的DNA樣品(generation=1.9)在離心管中顯示出強度相同的兩條黑帶,一條的密度和generation=1時候的一樣,另一條則等同於完全是14N的DNA。這樣的結果跟半保留機理推測的結果完美吻合:就這樣,關於DNA複製機理的爭論終於被Meselson和Stahl完美解決,而基因學和基因組學也得以在此後的五十年取得一系列重大突破。
機理證明
![半保留複製](/img/0/873/nBnauM3X2UTNxgTNycjMycTNyITMxEDM3QjMwADMwAzMxAzL3IzL1QzLt92YucmbvRWdo5Cd0FmLzE2LvoDc0RHa.jpg)
實驗結果表明:在全部由15N標記的培養基中得到的15N樳NA顯示為一條重密度帶位於離心管的管底。當轉入14N標記的培養基中繁殖後第一代,得到了一條中密度帶,這是15N樳NA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區帶,這表明它們分別為15N14N-DNA和14N14N-DNA。隨著以後在14N培養基中培養代數的增加,低密度帶增強,而中密度帶逐漸減弱,離心結束後,從管底到管口,CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度,不同重量的DNA分子就停留在與其相當的CsCl密度處,在紫外光下可以看到DNA分子形成的區帶。為了證實第一代雜交分子確實是一半15N-DNA-半14N-DNA,將這種雜交分子經加熱變性,對於變性前後的DNA分別進行CsCl密度梯度離心,結果變性前的雜交分子為一條中密度帶,變性後則分為兩條區帶,即重密度帶(15N-DNA)及低密度帶(14N-DNA)。它們的實驗只有用半保留複製的理論才能得到圓滿的解釋。第一代分子含有一條親代的鏈(用黑色素示),與另一條新合成的鏈(用白色表示)配對。在以後的連續複製過程中,原來親代的兩條鏈仍然保持完整,因此總有兩個分子各具有一條原來親代的鏈。MeslsonStahl實驗密度梯度離心後的DNA位置:左三管為對照;右三管為實驗結果.
實驗依據
![半保留複製](/img/1/be7/nBnauM3XwcjMzQDM1cjMycTNyITMxEDM3QjMwADMwAzMxAzL3IzLxIzLt92YucmbvRWdo5Cd0FmLzE2LvoDc0RHa.jpg)
(1)一條顯示放射性,另一條沒有放射性。
(2)染色體只有一半顯示放射性,而顯示放射性的每條染色體只有一條染色單體顯示放射性。
(一)第一代分裂後形成的每條染色體上的一個DNA分子兩條鏈一條有放射性一條沒有放射性,如果是半保留複製,以解鏇以後的兩條鏈為模板(一條有放射性一條沒有放射性)在普通培養液中形成的兩條子鏈都沒有放射性,這樣複製後的每條染色體都有一條染色單體具有放射性(以有放射性的那條母鏈為模板形成的)一條染色單體沒有放射性(以沒有放射性的那條鏈為模板形成的),所以第一次分裂中期每條染色體上都有放射性,而每條染色體上的兩條染色單體一條有放射性一條沒有放射性。
(二)在第一代分裂的基礎上進行第二代分裂,由於第一代分裂中期的每條染色體上的染色單體一條有放射性一條沒有放射性,所以著絲點分裂後形成的染色體就只有一半具有放射性了,而有放射性的染色體其中的DNA只有一條鏈具有放射性,如果是半保留複製,以解鏇後的兩條鏈為模板在普通培養液中形成兩條沒有放射性的子鏈,這樣有放射性的染色體複製後形成的兩條染色單體就只有一條染色單體顯示放射性。