研究進展
冷凍電鏡一方面，冷凍電子顯微鏡技術所研究的生物樣品既可以是具有二維晶體結構的，也可以是非晶體的；而且對於樣品的分子量沒有限制。因此，大大突破了X-射線晶體學只能研究三維晶體樣品和核磁共振波譜學只能研究小分子量（小於100KDa）樣品的限制。
另一方面，生物樣品是通過快速冷凍的方法進行固定的，克服了因化學固定、染色、金屬鍍膜等過程對樣品構象的影響，更加接近樣品的生活狀態。
21世紀初，冷凍電子顯微鏡都具備自動圖像採集系統。CCD(charged-coupledevice)照相機能快速、動態的記錄電子衍射圖，但由於像素的限制，其解析度不如照相膠片。CCD和照相膠片所記錄的是生物樣品空間結構的二維投影，利用各種計算機軟體程式包，可以從電鏡的二維圖像重構樣品的三維結構，即三維重構。已開發出許多軟體程式包可供計算機處理使用，大大方便了生物樣品的結構重構。
操作步驟
樣品準備
用於冷凍電鏡研究的生物大分子樣品必須非常純淨。生物樣品是在高真空的條件下成像的，所以樣品的製備既要能夠保持本身的結構，又能抗脫水、電子輻射。一種方法是通過快速冷凍使含水樣品中的水處於玻璃態，也就是在親水的支持膜上將含水樣品包埋在一層較樣品略高的薄冰內。該方法有兩個關鍵步驟：
一是將樣品在載網上形成一薄層水膜；二是將第一步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍。在多數情況下，用手工將載網迅速浸入液氮內可使水冷凍成為玻璃態。其優點在於將樣品保持在接近“生活”狀態，不會因脫水而變形；減少輻射損傷；而且通過快速冷凍捕捉不同狀態下的分子結構信息，了解分子功能循環中的構象變化。
另一種方法是通過噴霧冷凍裝置（spray-freezingequipment），利用結合底物混合冰凍技術(spray-freezing)，可以把兩種溶液（如受體和配體）在極短的時間內混合起來(ms量級)，然後快速冷凍，將其固定在某種反應中間狀態，這樣能對生物大分子在結合底物時或其他生化反應中的快速的結構變化進行測定，深入了解生物大分子的功能。
數據採集
冷凍電鏡拍攝的圖像一般情況下，用感光膠片記錄圖像。感光膠片和CCD記錄的都是樣品在垂直於電子束方向的二維投影像。由於象素的限制，SSCCD(slow-scancharged-coupleddevice)照相機拍攝的圖像的解析度不能和膠片記錄的圖像相比較，但是能更快速的反饋信息，因為膠片只有從電鏡中取出，經化學處理後才能觀察。而且SSCCD在記錄動態變化、線性、背景噪音等方面優於感光膠片。
一些因素如：輻射損傷、電子束誘導的樣品漂移和放電、電子束不均一等都能引起圖像質量的下降。低劑量照相技術能儘可能的減少電子束輻射損傷；而將樣品保持在液氦的溫度能進一步的保護樣品。
具有200KV或更高加速電壓並裝備場發射槍（fieldemissiongun）的現代電鏡較100kv加速電壓和熱發射槍（thermionicelectrongun）的傳統電鏡有很大的優越性。場發射槍產生的電子束具有更好的時間、空間一致性，提高CTF；高加速電壓能減少電子束誘導的樣品漂移和放電。冷凍含水生物樣品由於沒有經過化學固定、染色、金屬鍍膜，所獲得的圖像反差小。
冷凍含水樣品電鏡圖像的反差取決於樣品本身的散射反差、凍的厚度和物鏡的欠焦量等因素。樣品本身的散射反差與樣品結構有關，是無法改變的。冰層過厚與支持膜過厚一樣會降低反差，因此其厚度必須適當。改變物鏡欠焦量可以改變圖像的反差。欠焦下得到圖像在光學上是失真（opticaldistortion）的（用CTF描述），在進行中、高解析度的圖像分析時必須校正。在任何欠焦水平，總有一些圖像信息會丟失，因此需要在不同的欠焦水平下拍攝大量圖像，加以合成以彌補單一圖像丟失的信息。
三維重構
數據處理的最終目的是為了獲得生物樣品的三維質量密度圖。由於冷凍電鏡獲得圖像信躁比低，結構信息常常淹沒在躁聲中而難以辨認。只有通過大量拍攝生物樣品的同一個圖像，然後用某種方法加以平均來消除躁聲。由二維圖像推知三維結構的方法即三維重構。其理論原理是中心截面定理:即一個函式沿某方向投影函式的傅立葉變換等於此函式的傅立葉變換通過原點且垂直於此投影方向的截面函式。在1968年由DeRosier和klug提出。由於樣品的性質和有無對稱結構的不同，圖像分析的方法也有差異。但對於所有的生物樣品都有三個基本的任務要解決：
第一，必須得到不同方向的樣品圖像；第二，計算確定樣品的方向和中心並不斷加以最佳化；第三，無論在傅立葉空間還是真實空間，圖像的移位必須加以計算校正，以使樣品所有的圖像有共同的原點。
基於以上幾點，人們建立了三種解析生物大分子的基本方法：
一是電子晶體學（electroncrystallography）,利用電子與晶體的相互作用研究生物大分子的結構；
二是單粒子法（singlepaticleanalysis）,根據大量不同取向的相同顆粒的電子顯微圖像，重構生物大分子的結構；
三是電子斷層學（electrontomography）,根據樣品在一系列不同的傾斜角度下的多個電子顯微象進行三維重構。
套用前景
冷凍電子顯微鏡技術的快速發展，使其在生物大分子的結構研究中得到越來越廣泛的套用。對於具有二維晶體結構的生物樣品，能夠得到其高解析度的三維重構圖像，並直接用於解析其空間結構信息；對於非晶體的樣品，雖只能得到低解析度的三維重構圖，但可以為高解析度的X-射線晶體學和核磁共振波譜學所得到的亞結構提供模型。此外，通過捕獲樣品在不同狀態的結構信息，研究其構象的動態變化與其功能的關係。本文從樣品準備、數據採集、數據處理等步驟，對冷凍電子顯微鏡技術在生物大分子的三維結構研究中的套用進行綜述，並舉例說明這項技術的優越性。
研究成果
清華大學顏寧教授2019年1月，北京大學物理學院人工微結構和介觀物理國家重點實驗室、前沿交叉學科研究院定量生物學中心毛有東課題組在《自然》雜誌上發表的論文表明，他們通過冷凍電子顯微鏡和機器學習技術的結合，解析了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間態構象的高分辨（2.8埃—3.6埃）精細原子結構，局部解析度最高達到2.5埃。
