冷凍蝕刻電鏡技術

凍蝕刻(Freezeetching)技術是從50年代開始發展起來的一種將斷裂和復型相結合的製備透射電鏡樣品技術，亦稱冷凍斷裂(Freezefracture)或冷凍復型(Freezereplica)，用於細胞生物學等領域的顯微結構研究。

概述

冷凍蝕刻技術

冷凍蝕刻(Freezeetching)技術是從50年代開始發展起來的一種將斷裂和復型相結合的製備透射電鏡樣品技術，故而亦稱冷凍斷裂(Freezefracture)或冷凍復型(Freezereplica)。

優點

①樣品通過冷凍，可使其微細結構接近於活體狀態；
②樣品經冷凍斷裂蝕刻後，能夠觀察到不同劈裂面的微細結構，進而可研究細胞內的膜性結構及內含物結構；
③冷凍蝕刻的樣品，經鉑、碳噴鍍而製備的復型膜，具有很強的立體感且能耐受電子束轟擊和長期保存。

缺點

冷凍也可造成樣品的人為損傷；斷裂面多產生在樣品結構最脆弱的部位，無法有目的地選擇。

裝置型號

裝置圖

目前，冷凍蝕刻裝置的型號很多，但主要分為兩種類型：一種是專用冷凍蝕刻裝置，如EIKO公司生產的FD2A型、FD3型，BALZERS公司生產的BAF300型；另一種是真空噴鍍儀的冷凍蝕刻附屬檔案，如日立公司生產的HFZ1型，它與FE1型加溫蝕刻裝置一起安裝在HUS5型真空噴鍍儀中使用。以上兩種類型各有優缺點，專用裝置優點在於操作方便，能連續制樣，效率高。缺點是價格貴；附屬檔案裝置價格雖便宜，但不能連續操作，效率低。

操作方法

冷凍蝕刻的操作方法按以下步驟進行。

顯微圖像

1.預處理取新鮮組織塊，大小為15～3～5mm，用25％戊二醛固定1～3小時。為防止冰晶形成，用30％甘油生理鹽水浸泡8～12小時。
2.冷凍斷裂是在冷凍條件下使樣品變得又硬又脆，用刀劈裂樣品，暴露觀察面。因為是用刀劈裂的樣品，斷裂往往發生在細胞被凍結後較脆弱的部位，多數是沿細胞及細胞器的膜裂開。由於斷裂面是凸凹不平的，所以圖像立體感強。冷凍斷裂時，刀的作用在於劈裂，而不是切割，所以刀刃不必鋒利，但不能有缺口、油污和水份，還需保持清潔乾燥。冷凍復型的斷裂操作要在真空中進行，是因為真空對熱傳導性差，能使樣品較長時間維持在較恆定溫度下進行斷裂操作，同時也便於進行下步的蝕刻處理。儀器中進行斷裂的最佳條件：真空度為133×10-5～3×40-3Pa(1×10-5～3×10-5Torr)，樣品升溫至-100℃～-110℃。
3.蝕刻就是在真空中使冷凍樣品表面上的冰升華。目的是為了暴露出樣品斷裂面上的超微結構，便於噴鍍。一般認為最佳蝕刻深度約為30nm。若蝕刻深度不夠，結構被冰掩蓋不能充分暴露出來，圖像模糊；若蝕刻深度過大，超微結構因其基礎支持不足而倒塌，從而破壞了超微結構。蝕刻深度是由蝕刻速度和蝕刻時間決定的，而蝕刻速度是受真空度、溫度、水蒸汽壓所影響。一般蝕刻條件：真空度為133×10-3～133×10-4Pa(10-5～10-6　Torr），溫度降至-100℃，在此條件下，蝕刻速度大約為2nm/s。
4.噴鍍即在樣品斷裂面上噴鍍一層鉑膜及碳膜。鉑膜厚度為2～5nm。為使圖像具有立體感，噴鉑的方向與樣品成45度角。為加固鉑膜強度，再噴鍍一層碳，噴碳的方向與樣品面成90度角。
5.剝離清洗噴鍍後，將樣品取出放入10～30％次氯酸鈉腐蝕液中，樣品漸冒氣泡並與復型膜分離。隨後用蒸餾水仔細清洗復型膜。
6.撈膜將清洗後的復型膜撈在不加支持膜的400目載網上，待乾後電鏡觀察。

套用

1．冷凍蝕刻表面標記免疫電鏡技術
（1）新鮮或固定的細胞進行直接法或間接法免疫標記。
（2）PBS（pH7.5）沖洗3min×2，加入1mmol/lMgCl2蒸餾水洗洗3min×3，離心沉集細胞。
（3）將細胞團置於小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進行斷裂操作，再於-100℃蝕刻1min。
（4）製做斷裂面復型。
（5）再次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗後進行觀察。
本法可顯示斷裂暴露的PF位於中央，周圍則是蝕刻後露出來的ES，標記物只出現在ES上。
2．斷裂—標記免疫電鏡技術
此法是先進行冷凍斷裂，再做免疫標記，從而可以對斷裂開的各種膜結構及胞漿斷面進行標記。
（1）臨界點乾燥法
①固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS沖洗3min×3。
如為細胞懸液，可加入30%BSA後加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油—PBS浸透後置於用液氮冷卻的Freon中冷卻。
②冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養皿中，培養皿放置於二氧化碳—液氮槽中，用預冷的解剖刀切割凝膠小塊進行冷凍斷裂。
③解凍，置碎塊於30%甘油—1%戊二醛磷酸緩衝液中解凍。
④置換甘油，放入1mmol/l氨基乙醯甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。
⑤免疫標記。
⑥1%鋨酸，室溫固定30min。
⑦系列梯度乙醇脫水，臨界點乾燥，噴鍍鉑—碳膜，次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗，撈於有Formvar膜銅網上透射電鏡觀察。
（2）超薄切片法
步驟：①至⑤同臨界點乾燥法。
⑥1%鋨酸，室溫固定2h，系列酒精或丙酮脫水，常規電鏡包埋。
⑦切半薄片，光鏡定位合適的斷裂部位，再切超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。
斷裂標記法目前文獻報告套用較多的是植物凝集素—膠體金免疫標記技術，常用的如刀豆球蛋白（ConA）--膠體金免疫標記技術.ConA能與細胞膜中的甘露糖結合，能標記內質網膜、核被膜以及細胞膜的EF面，有助於糖蛋白在超微結構水平的定位。
為保證實驗結果的準確性，每組實驗在免疫標記階段應設立對照組。對照組的設計同第一章　總論中的免疫對照染色。