個體配子DNA序列PCR分析
高等生物遺傳圖譜的構建依賴於選擇性雜交後代的分析或者通過家系分析法來計算連鎖關係。對人類而言僅後者是可行的。使用長度多態性限制片段（RFLpS）在構建人連鎖圖譜方面已取得長足的進步。為了對帶有與已知表現型相關的RFLp標記的基因進行定位，首先得建立間隔約10CM的遺傳標記束（平均1CM等於1%重組），這樣沒有基因離標記RFLp的距離會超過5CM。可靠的統計表明家系分析能夠檢測的遺傳間距精確到1cM(1cM相當於1000kb的DNA。分析更小的遺間距需要檢測家族內大量的個體，而這實際上是行不通的。最近發展了一種不依賴遺傳交*或家系分析的方法檢測遺傳標記間的重組頻率。具體方法是直接決定配子(精子)的基因型是親本型還是重組型。這通過確定兩個等位基因中哪一個存在於雙雜合男性精子上的兩個基因座點其中之一來完成。根據上述方法確定的重組精子的數量被總檢測精子數除就可估計出重組頻率。已知聚合酶反應在體外擴增基因能夠使DNA擴增109倍，因此該技術有可能分析精子中單分子靶DNA。以這種方式研究數千個人精子就有可能構建比家系分析要精確得多的遺傳圖譜。該方法提供了一個獨物的手段來研究許多現在被認為是不能解決的人類遺傳學領域的難題。
用pCR確定精子類型的原理
理論和試驗
從人類家系分析的觀點來看，每個個體都是親本減數分裂產生的單個產物的融合體。雙親以及後代體細胞DNA的研究加上適當的統計學方法可推知形成合子的減數分裂產物的重組或非重組的性質，同時可以估計重組在減數分裂中所占的比例。我們研究遺傳重組的方法與上述的不同，它通過分析減數分裂產物本身的DNA來決定減數分裂發生重組的比率。每個男性一生中可產生大量的減數分裂產物精子，從而提供了進行遺傳分析取之不盡的實驗材料。假設一個男性雜合子有兩個連鎖基因座。每一個基因座的多態性差異在於AT-AT或GC-GC)要么是重組型(AT-GC或GC-AT)。重組類型出現的頻率將取決於兩個基因座彼此間的遺傳間距。通過檢測某一個體的大量精子，可精確地計算出四種精子類型出現的頻率。該技術存在的困難在於確定減數分裂前細胞中的每個基因座上存在的兩種等位基因中的哪一個進入單個精子。常規的分子生物學技術沒有足夠高的靈敏度分析精子染色體DNA的單個分子。
分析和結論
pCR擴增每個基因座的多態性區域是分析精子的第一步。兩個基因座用兩組引物，同時引物必須位於多態性區域的邊側。當精子兩個靶序列經pCR擴增，就確定了每個基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探針可識別等位基因小到僅發生單個鹼基置換的實驗方法已得到改進，這些等位基因牧場劃的寡聚物（ASO）探針第一次套用是將人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因與鐮刀形紅細胞（βA）的突變區分開來。本方法檢測等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的長19bp)。每個寡核苷酸與一個等位基因完全互補而與另一個等位基因通常只有一個鹼基的差別。同位素標記的寡核苷酸分別與待檢測擴增的DNA樣品雜交。在適當的雜交條件下，只有樣品中的序列完全互補時，寡核苷酸可形成穩定的雙螺鏇。例如，精子的pCR產物用四種ASO探針分析。有一對ASO分別將基因座1的兩個等位基因區別開，另一對將基因座2的兩個等位基因區別開。實際上，預期兩個ASO中只有一個與某一個減數分裂產物雜交，可以確定每個檢測的精子對於所研究的染色體而言實際上是單倍體。
人單倍體細胞有1.5-5X10-24摩爾單一DNA序列。根據以前的實驗結果，我們知道活性達5μCI/微微摩爾的同位素標記就能夠在不到一天的時間內檢測出1毫微微摩爾（10-15/10-24）。即使以較低的平均擴增效率，大約經50個擴增循環便可完成。
單個細胞的pCR分析
對單二倍體細胞的研究
在分析單精子以前，Li等人對個體二倍體細胞內的β珠蛋白基因進行過研究。兩個組織培養細胞株用於這些實驗。其中一個純合是鐮刀型細胞密碼子6（βS）發生突變，另一個純合子則來源於正常的βb等位基因。擴增含有密碼子6的β珠蛋白片段的引物，及能夠區別這兩個特異的等位基因的寡核苷酸探針（ASO）已經報導過。βA純事細胞和βb純合細胞和βS純合細胞在同一組織培養瓶中共同培養數天。將用相差顯微鏡觀察到的混合培養的單個細胞轉入溥塑膠胡管內。分別將單個細胞轉入含裂解液的pCR管中，保溫後，加入pCR緩衝液，緩中有四種dDNp．TaqDNA聚合酶和擴增已知珠蛋白基因的pCR引物。95℃10分鐘變性靶DNA，然後根據已發表方法的改進方案進行50全循環的擴增。通過打點雜交，等量的擴增產物打點於尼龍膜後，擴增產物分別與βA和βS的探針雜交。所分析的37個細胞中，84%細胞只與βA和βS探針雜交，雜交強弱各不相同；19個與βA探針．12個與βS探針雜交。12個以水作空白對照的反應管中瓜呈陰性，它表明忽略不記DNA的污染。沒有與兩種探針都雜交的樣品，它暗示轉入到反應管中的單個細胞，而且組織培養基中存在的從βA或βS細胞中裂解出來的DNA並未吸附在單個細胞上。進階擴展
單個細胞的pCR擴增產生的β珠蛋白基因的數量通過與已知攜帶蛋白基因的質粒DNA樣品在雜交模上的雜交信號的強度進行比較確定。據估計pCR反應開始時，一個二倍體細胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩爾）在5－500毫微微摩爾之間，每個pCR循環以平均效率65%計算，經50個循環後它的DNA相當於平均擴增了7.6×1010倍。考慮到擴增的程度之大，因此排除任何可能的污染對於單個細胞的分析十分關鍵。單精子的分析
Li等人隨後對位於染色體19編碼LDL受體(LDLR)的基因的雜合體單精子的基因型進行分析。根據已知的DNA序列，他們用pCR和ASO分析檢測LDLr的RFLp。pCR的引物和探針以前已有報導。單個精子的分離與二倍體細胞的分離方法一樣，精液經蔗糖梯度離心得到純化的精子，精子於－20℃可保藏8個月。顯微鏡下將單個精子吸入毛細塑膠針管內，然後轉入試管內以作裂解。裂解的方法與發表的方法沖液(50mMKCL，10mMTris.HCL，pH8.3，2.5mMMgCl2，0.1mg/ml明膠），0.05mg/ml蛋白酶K，20mMDTT和1.7μMSDS。37℃保溫1小時，加入pCR反應物以前，樣品加熱到85℃。pCR擴增。對80個精子LDLr基因型已作過分析。55%的雄配子顯示出雜交信號。22個攜帶LDLr等位基因，21個攜帶LDLr2基因。僅一個與兩種探針雜交都呈陽性。16支對照反應管中加入所有反應試劑但沒有精子，結果無雜交信號出現。兩個擴增的等位基因的分布遵循Mendel獨立分離定理，它表明pCR反應以單個減數分裂產物為起始，無污染的二倍體DNA存在。Li等人隨後又對進行重組研究十分關鍵的單精子的兩個不同基因座的DNA序列進行擴增。供體雄配子的第六條染色體上的HLAAQα基因座及第十九條染色體上的LDLR基因是雜合的。最初想在LDLR和DQα引物存在的條件下同時擴增兩個基因座的全序列的努力未能成功。取而代之，在兩對引物存在時，先擴增20個循環，經這種最初擴增以後，將1/50反應混合物加入試管內，用只含HLA引物的pCR緩衝液稀釋，另一份同等量的反應混合物經只含DLDR引物的pCR緩衝稀釋，再進行45個擴增循環以後，用第二次反應產物的一部分與具有等位基因位點特異的兩個ASO雜交。123個樣品（85%）有雜交信號。剩下的27個樣品無擴增位點。123個樣品中有9個至少發現在兩基因座其中之一有兩個等位基因，而對這些樣品未作進一步的分析。這些樣品中可能有不同基因型的兩種精子，而不是由於減數分裂連鎖造成的。因為最近細胞學有關人精子的研究結果表明單個染色體的平均連鎖頻率在0.1%水平，遠遠低於所觀察到的頻率。
在剩下的114個精子中，LDLR基因座有96個已經定型，其中45個為LDLRL、51個為LDLR2。兩等位基因的比率理論值為1：1（平方差=0.375，0.75>p>0.5ldf)88個的DQα等位基因的分離處於具有統計學意義的臨界值（平方差=3.68，0.1>p>0.05，ldf)。上述結果表明：1）統計上的不穩定性，2）由於該基因座具有大量的多態性，pCR引物與供體DQαDNA序列之間的錯配導致兩個DQα等位基因不均等擴增，或3）一些異常的遺傳現象如異常分離。
