原理
細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA Ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上螢光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，從而可以通過螢光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。
實驗方法
1. 對於貼壁細胞或細胞塗片a. PBS或hbss洗滌一次。
b. 如果細胞貼得不牢，可以乾燥樣品使細胞貼得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧雲天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧雲天生產的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育2分鐘。
f. 轉步驟5。
a. 收集細胞(不超過200萬細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水
平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1％ Triton X-100的PBS重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉步驟5。
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌乾淨，否則會嚴重干擾後續的標記反應。
d. 轉步驟5。
a. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1％ Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉步驟5。
參考下表配製適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配製好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。
| 1個樣品 | 5個樣品 | 10個樣品 | |
| TdT酶 | 2μl | 10μl | 20μl |
| 螢光標記液 | 48μl | 240μl | 480μl |
| TUNEL檢測液 | 50μl | 250μl | 500μl |
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以儘量減少TUNEL檢測液的蒸發。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗螢光淬滅封片液封片後螢光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長範圍為450-500nm，發射波長範圍為515-565nm(綠色螢光)。
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或塗片後在螢光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長範圍為450-500nm，發射波長范
圍為515-565nm(綠色螢光)。
常見問題
1. 出現非特異性螢光標記a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的螢光標記。解決方法是，取細胞或組織後立即固定並且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
b. 使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議採用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性螢光。注意控制反應時間，並確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。
b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應過強。可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍後再按照說明書操作。稀釋後的TdT酶需當日使用。
d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發螢光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b. 固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。
c. 螢光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的螢光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
例圖
作者自製，不得移做他用！
Control
Experiment