《PCR技術檢測病毒》書籍信息
著作者：西安交通大學醫學院
出版社：人民衛生音像出版社
ISBN號：7887201551
出版日期：2006-12-1
裝幀：簡裝
定價：38元
檢測Cox.病毒
pcr技術 柯薩奇病毒(Coxsackieviruses簡稱Cox.病毒)是1948年Dalldorf等採用新生小鼠研究脊髓灰質炎病毒時，在紐約附近的Coxsackie分離發現的一種腸道病毒，屬小RNA病毒科，可分為A、B二組.A組有23型(A1-22，24)，B組有6型(B1-6)，與A組的A9型有共同的組特異性抗原.Cox病毒可引起許多不同的臨床症侯，甚至同一病毒可以引起不同的疾病(表1)，近年通過PCR技術證明，除可導致腦炎、腦膜炎外，是心肌炎、心包炎的重要病原，其持續感染可能與特發性擴張型心肌病密切相關.本文簡述PCR技術在Cox病毒檢測中的套用。
一、Cox病毒基因與PCR引物設計
Cox病毒為腸道病毒屬，其基因結構具有小RNA病毒科的共同特徵(如圖所示)，可分為衣殼蛋白基因區，無性繁殖功能區和非編碼區，其5'-末端即位於衣殼蛋白基因外的鹼基序列同其他小RNA病毒具有較高的交叉性。
病毒感染引起的主要臨床症侯
主要臨床症侯組主要型別
無菌性腦膜炎A2，4-7，9，10，12，16
B所有型別
皰疹性咽峽炎A1-6，8-10，16，21，22
急性上感A2，10，21，24
B1-5
心肌炎B2-5
心包炎B1-5
麻痹疾病A4，7，9
B3-5目前，根據Cox病毒基因的序列研究結果，人們選擇高度保守的編碼區和5'非編碼區(如nts461-640)，已設計了多對引物，用於Cox病毒A組和B組的擴增及特異性擴增CoxB3病毒.但由於Cox病毒與其小RNA病毒基因之間有高度的同源性(70-90%，位於VP1基因)，目前設計的引物除CoxB3病毒特異性引物外，其餘的引物均可用於擴增CoxA組和B組病毒，並同脊髓灰質炎病毒有較高的交叉反應.
Cox病毒PCR擴增所用引物及探針
引物及序列位置片段意義
探針(5'-3')(核苷酸)(bp)
P1(＋)CGGTACCTTTGTGCGCCTGT64-83414用於擴增CoxA16，21
P2(－)TTAGGATTAGCCGCATTCAG459-478CoxB1-6及探針TATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG430-455P3(＋)CAACTTAGGAGAAAGCTAGA2745-2764147CoxB3特異性引物
P4(－)CACCTGGTGGTACATACATA2873-2892探針CGGTTCGACCTGGAGCTGAC2781-2800
P5(＋)GCAACTCCCATCACCTGTAC6718-6737186CoxB2-4，PV1
P6(－)ATCACATCATCAACCATATGC6885-6904探針TACTTTGTGAGGGGTGGCAT6750-6769
P7(＋)TATGGTGATGATGTGATCGC6889-6908300探針TACTTTGTGAGGGGTGGCAT6750-6769
P8(－)TCCCCGTTATGCCAAGCTAA7170-7189探針TTGGATCCTTGGTCCATCTA7115-7134
P9(＋)TGCGGCTAATCCTAACTGCG461-480179探針TTGGATCCTTGGTCCATCTA7115-7134
P10(－)CCGGATGGCCAATCCAATA621-640探針CGGTTCCGCTGCAGAGTTGC522-541
pcr技術檢測按常規方法收集鼻咽分泌物、糞便、心肌活檢材料及腦脊髓液等標本後，應在0-4℃條件下立即送實驗室，分裝保存於-20℃或提取模板.由於體液和組織中RNase含量較高，影響製備病毒RNA，故在製備RNA前應按100Ul標本中加40U的RNase酶抑制RNasin.
三、模板RNA製備
1.酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿法:適用於從心肌等活檢標本或細胞培養標本.①先將標本(1.5mm3)或1×107細胞研磨勻漿，加入1ml裂解液(4mol/L異硫氰酸胍-25mmol/L檸檬酸鈉PH7.0，50mmol/L2-硫基乙醇，0.5%Sarkosyl)，混合後冰浴中作用15min.②分別加入1/10體積的2mol/LNaAc(PH4.0)，等體積飽和酚，2/10體積的氯仿，混合作用15S.③15000r/min離心15min，收集水相，加入等體積的異丙醇，1-20℃2h，再次離心，用75%乙醇洗一次，收集RNA沉澱。
2.酚-氯仿抽提法:適用於從體液標本中製備RNA.①取體液標本100Ul於反應管中加入2%，使終濃度為0.5%，再與等體積的酚:氯仿(1∶1)混交，15000g離心15min，收集上層水相.②再向原反應管的有機中加入含0.5%SDS的TNE溶液(10mmol/LTris-HCLPH7.5，100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA)，提取一次，同上離心，收集水相.③將兩次收集的水相合併，加入NH4AC溶液，使以濃度為2mol/L，加2.5倍體積的冷無水乙醇，-20℃置2h以上，15000g離心(4℃)30min，棄上清，收集沉澱，用20UlTE(PH7.5)稀釋(含40U的RNasin)。
四、逆轉錄
取5UlRNA提取模板加入20Ul反應混合液(含50mmol/LTris-HClPH8.4，6mmol/LMgcl2，10mmol/LDTT，50mmol/LNaCl，250mmol/L的dATP，dCTP、dGTP、dTTP，1umol/L下游引物P2)及40UAMV逆轉錄酶;再加25-50Ul礦物油封頂後於42℃反應1h，使RNA逆轉錄為cDNA。
五、PCR擴增
①取上述逆轉錄後的反應混合物20Ul，加PCR反應液至100Ul反應體積.PCR反應液含有終濃度為50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HClPH8.4，1mmol/LMgCl2，100Ug明膠，引物1和引物各1Umol/L及四種dNTP各200Umol/L.
②混勻後，94℃水溶5min，冷至55℃。
③加入2.5UTaq聚合酶，振盪搖勻，用100ul礦物油封頂。
④94℃變性2min，55℃退火2min，72℃延伸2min，重複35個循環.最後於72℃延伸10min。
⑤為提高某些標本檢測的敏感性，可取第一次擴增產物1Ul，作模板，加入PCR試劑進行第二次擴增(20-25個循環)。
六、擴增產物的檢測
(一)電泳法：取10Ul的PCR產物於1%或2%瓊脂糖凝膠上電泳，以EB染色顯示PCR產物，如出現與目的片段大小相同的擴增產物，則判為陽性。
(二)雜交法：
1.將PCR產物與等體積的0.6mol/LNaOH混合，室溫作用15min後，轉移到尼龍膜上。
2.用100Ul2mol/L，NH4AC溶液中和後，將濾膜置真空爐中烘烤2h。
3.將膜置於5XSSC-1%SDS-0.5%BSA的緩衝液作預雜交。
4.再於含50Ul0.4Umol/L鹼性磷酸酶標記探針的預雜交液中，45℃，15min。
5.用1%SDS-1×SSC液及1%TritonX-100液100ml，先後各洗2次，再用1×SSC洗1次。
6.將濾膜浸入7.5ml鹼性磷酸酶混合物中室溫顯色3-4h，然後雙蒸水洗滌，終止反應。
七、套用和發展
目前，套用上述引物，可進行Cox病毒感染的診斷，特別是用CoxB3病毒的特異引物，擴增病人心肌活檢標本中該病毒的核酸，具有很高的敏感性和特異性，同其他Cox病毒及小RNA病毒無交叉反應，並證明CoxB3是心肌炎的重要病原，同原發性擴張型心肌病密切相關，故隨著此技術的深入套用，將有助於揭示上述心臟病的真正病因.當然，目前PCR引物的設計還需進一步解決Cox病毒A組、B組特異性引物及型特異性引物問題，這樣才能進一步用於臨床診斷及分子流行病學的研究，同時也有助於了解Cox病毒變異的規律，為研製預防用的疫苗奠定基礎。
PCR技術套用
pcr技術檢測PCR技術套用二：骨腫瘤診斷
PCR技術套用三：突變基因檢測
PCR技術套用四：遺傳病診斷
PCR技術套用五：苯酶同尿症診斷
PCR技術套用六：血友病A基因診斷
PCR技術套用七：地中海貧血
PCR技術套用八：DMS/BMD基因診斷
PCR技術套用九：檢測人COX病毒
