定義
逆流色譜法法（CCC）原理是基於樣品在兩種互不混溶的溶劑之間的分配作用，溶質中各組分在通過兩溶劑相過程中因分配係數不同而得以分離。是一種不用固態支撐體的全液體色譜方法 。
分類及發展歷程
液滴逆流色譜（DCCC）
液滴逆流色譜是在逆流分溶法基礎上創建的色譜裝置，可使流動相呈液滴形式在固定相間交換，促使溶質中各組分在兩相之間進行分配，達到分離效果。該法缺點是流動相流速低，每小時只有十幾毫升；分離過程長，一般需要幾十小時才能完成一次幾個組分的分離．
離心液滴逆流色譜（CPC）
比DCCC進步的地方就是使用離心加快重力分離。離心液滴逆流色譜更通用的叫法是離心行星色譜，使用很小的直管和毛細管（用多性塑膠製成多層的）。一套實用的儀器包含數以千計的直管，可以獲得幾百個理論塔板數的效能。CPC的缺點和DCCC相似，只是用離心代替了地球重力分離。另外，CPC還多了個缺點，就是它在流動相的進口和出口必須使用旋轉流體密封件；而這些密封件性能不好，價格又高，容易損耗，並且限制了泵液的壓力，進而限制了流速和離心速度。
高速逆流色譜（HSCCC）
高速逆流色譜技術是一種不用任何同態載體的液-液色譜技術，其原理是基於組分在旋轉螺旋管內的相對移動而互不混溶的兩相溶劑間分布不同而獲得分離，其分離效率和速度可以與HPLC相媲美 。
HSCCC發展歷史
高速逆流色譜是在1982年，美國國立衛生院的一個教授首先研究和發展起來的一種不同於傳統液相色譜法的現代色譜分離製備技術。作為一種新的色譜技術，HSCCC分離系統可以理解為以螺旋管式離心分離儀代替HPLC的柱色譜系統。HSCCC不使用固相載體作固定相, 克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點。由於不需要固定相，HSCCC技術具有進樣量大、無不可逆吸附等優於其他色譜技術的優點，此項技術已經被廣泛地套用於醫藥、環境、化工等領域 。
HSCCC原理詳解
HSCCC原理
高速逆流色譜分離原理結合了液液萃取和分配色譜的優點，是一種不需任何固態載體或支撐的液-液分配色譜技術，其基本分離原理與其他同類色譜技術相同，主要是利用物質在兩相間分配係數的差別進行分配。而HSCCC將兩溶劑的分配體系置於高速旋轉的螺旋管內，螺旋管的運動形式，是在自身自轉的基礎上，同時繞一公轉軸旋轉，形成行星運動。由此加在分配體系上的離心力場不斷發生變化，使兩相溶劑充分的混合和分配，從而達到洗脫分離目的。因為樣品中各組分在兩相中分配係數不同，導致組分在螺旋柱中的移動速度不同，因而能使樣品組分按分配係數的大小次序被依次洗脫下來的一種色譜分離技術。在流動相中分配比例大的先被洗脫, 在固定相中分配比例大的後被洗脫。
固定相的保留
在高速逆流色譜儀設計方面，其有兩個軸，其中一個為公轉軸，一個為自轉軸，兩個軸由一個電動機帶動。儀器的公轉軸呈水平方向，圓柱形的螺旋管支持件圍繞此軸進行行星式運轉，同時圍繞自轉軸進行自轉。由於螺旋管柱的行星式運動產生了一個在強度和方向上變化的離心力場，使在螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合從而達到穩定的流體動力學平衡，兩相分離成兩層，重相占據螺旋管的每一段的外部，輕相占據每一段的內部，並且兩相沿螺旋管形成一個清晰的線性界面。所以可以根據所用體系液體的流動趨勢選用合適的模式，使得其中一相作為固定相保留在螺旋管中，另一相作為流動相併帶著樣品(溶質) 進入螺旋柱並不斷反覆穿過固定相。這一過程頻率極高，當柱心以800r /min旋轉時，頻率超過每秒13次。流動相從固定相流動的相反方向泵入，以阻止固定相的運動，使固定相保留在色譜柱內，高速逆流色譜法就是利用了這種現象來實現高速分離的。
溶劑系統
溶劑體系的要求及分類
HSCCC是利用溶質在不同溶劑中的分配的分配係數不同進行分離的，所以在溶劑選擇時要重點考慮溶質在兩溶劑中的分配係數，那么其分離物質的關鍵是溶劑系統的選擇。對於分離的溶劑體系, 應該滿足以下幾方面的要求：1)不造成樣品的分解與變性，且不與之發生反應；2)對樣品有足夠高的溶解度；3)樣品在溶劑體系中有合適的分配係數值(K應在0.5-2之間)；4)溶劑體系的各組分應分成體積比例適合的兩相, 以免浪費溶劑；5)固定相能實現足夠高的保留，且要滿足一定的要求(保留值越大峰形越好)。因而準確測定待分離組分在兩相中的分配係數，便可選擇出合適的溶劑系統。
常見的溶劑體系按極性分類有以下幾種：1) 強極性溶劑體系；2) 中等極性溶劑體系；3) 弱極性溶劑體系；4) 極弱極性體系(無水體系)；5）加酸體系等。這五種溶劑體系分別可以用於分離相應性質的天然產物。
1、 強極性體系
正丁醇體系：該體系的基本兩相由正丁醇和水組成，可根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於正丁醇和水之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。一般加入甲醇、乙醇、丙酮作為調節劑，組成三元溶劑體系。該體系一般不是很常用。
醋酸乙酯體系：該體系是HSCCC分離常用的體系之一，基本兩相由醋酸乙酯和水組成，可根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於醋酸乙酯和水之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。一般加入甲醇、乙醇、正丁醇作為極性調節劑，組成三元或四元溶劑體系。用該類溶劑系統分離的物質基本上都屬於苷類， 且大多數苷的苷元都比較簡單，多數含有多個羥基，有的苷含有多個糖，常用於分離黃酮苷、苯丙素苷以及一些皂苷。最常用的溶劑體系有：醋酸乙酯-正丁醇-水、醋酸乙酯-甲醇-水、醋酸乙酯-乙醇-水、醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水。這些常用的體系極性相差不大，只有醋酸乙酯-乙醇-水的極性稍微小點，不常用於分離含有多個糖的苷。
2、中極性體系
甲基叔丁基醚體系：該體系的基本兩相由甲基叔丁基醚和水組成，可根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於甲基叔丁基醚和水之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇、乙腈作為極性調節劑，組成四元溶劑體系，三元的甲基叔丁基醚體系不是很常見。可以用於分離含羥基不是很多的苷類和極性較大的萜苷，以及含有多個羥基和羧基的非苷類物質。甲基叔丁基醚體系和醋酸乙酯體系的極性相差很小。
氯仿體系：該體系是HSCCC分離常用的體系，基本兩相由氯仿和水組成，可根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於氯仿和水之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇作為極性調節劑，組成三元或四元溶劑體系。其中運用最多的是氯仿-甲醇-水體系，氯仿體系可用於分離含有糖的苷, 也可分離不含有糖且含有一些羥基的苷元。但是甲醇在溶劑體系中的比例很接近或者大於氯仿在溶劑體系中的比例時，氯仿-甲醇-水體系可以分離含有多羥基的苷類物質，其極性甚至可以達到與醋酸乙酯體系極性似的程度。常用於分離黃酮、苯丙素、蒽醌、多酚及其苷。
3、 弱極性體系
正己烷體系 : 該體系是HSCCC分離常用的體系之一，基本兩相由正己烷和水組成，可根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於正己烷和水之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙腈、氯仿作為極性調節劑，組成三元或四元溶劑體系。其中運用最多的是正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水、正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水、正己烷-甲醇-水、正己烷-乙醇-水、正己烷-醋酸乙酯-水。一般用正己烷體系分離小極性非苷類物質，被分離物質中極性基團很少。常用於分離黃酮、苯丙素、蒽醌和一些萜類化合物。其中正己烷-甲醇-水、正己烷-乙醇-水分離物質的極性很小，基本不含羥基。而正己烷-醋酸乙酯-水分離的物質極性最大，可以分離含有多個羥基的物質，甚至能分離苷類。而正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水、正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水，這兩個溶劑體系的分離極性範圍很廣。
石油醚體系 : 該體系的基本兩相由石油醚和水組成，可根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於石油醚和水之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。一般加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯作為極性調節劑，組成三元或四元溶劑體系。其中運用最多的是石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水。用該體系分離的大多數物質都不含有羥基，很少用該體系分離苷類物質，只有當苷元分子較複雜且極性很低時可以用於分離由該苷元組成的苷。降低石油醚的比例，也可以分離一小部分的苷。
4、 極弱極性體系 ( 無水體系 )
現在大多數用於HSCCC分離的無水體系都是用乙腈代替水與小極性溶劑組成基本兩相，再根據需要在上下兩相中加入不同體積比且極性位於小極性溶劑和乙腈之間的惰性溶劑來調節溶劑系統的極性。該溶劑系統可以用來分離極性非常小的物質，這種物質一般含有較多碳，基本上不含有極性基團，適用於分離小極性的甾體、萜類以及多碳烷烴。常見的無水體系有正己烷體系，其基本兩相由正己烷和乙腈組成。
5、 加酸體系
在極性相對小的溶劑體系中加入酸鹼會增大溶劑體系的極性。常在溶劑體系中加入鹽酸、醋酸、三氟乙酸、磷酸鹽。這種加了酸鹼的溶劑體系常用於分離具有酸鹼性質的物質，如生物鹼、有機酸和酸性較強的黃酮類化合物。氯仿-甲醇-稀鹽酸溶劑體系就常常用於分離生物鹼類的物質，可以說氯仿-甲醇-稀酸體系是分離生物鹼的專用體系。
溶劑體系選擇及組分分配係數的測定
選取一個合適的溶劑體系步驟：(1) 通過TLC或者HPLC預測被分離物質的極性。(2) 根據極性選擇合適的分離體系。(3) 如果得知與被分離物質極性相似物質的分離體系，可以借鑑。在選擇溶劑系統時就需要測定組分的分配係數, 而分配係數測定常採用高效液相色譜法或薄層色譜法，這兩種方法都能夠較準確地測出特定組分的分配係數值。HPLC法是將適量的樣品分別溶於已平衡的兩相溶劑，待分配平衡後，進行HPLC的測定，通過得到的色譜峰面積可精確計算出樣品在兩相間的分配係數。薄層色譜法則是利用樣品在等體積上下相中分配平衡後用薄層色譜展開, 通過薄層色譜得到的斑點判斷組分的分配情況。不同的體系，有著不同的平衡時間(不同溶劑系統中，從兩相溶劑系統的上相與下相溶劑混合時，直到兩相系統達到完全分層的時間)，其影響著系統的分離效能，與固定相的保留率密切相關。
如果要同時分離多種物質，首先要預測被分離物質的極性，根據極性的大小來選擇分離體系。如果被分離物質的極性都比較大, 可以選用醋酸乙酯體系；如果被分離物質一部分極性大，一部分極性中等可以選用氯仿體系；如果被分離物質一部分極性中等，一部分極性較小可以選用正己烷體系；如果被分離物質極性都較小可以選用石油醚體系 。
實驗操作及影響因素
實驗操作
在進行分離純化時，首先將固定相充滿於色譜柱，而後色譜柱即圍繞自身軸進行自轉；同時圍繞設備中心軸進行高速公轉(即行星式運動)，再將流動相泵入色譜柱。在此之前，首先選擇預先平衡好的兩相溶劑中的一相為固定相，並將其充滿螺旋管柱，然後使螺旋管柱在一定的轉速下高速旋轉，同時以一定的流速將流動相泵入柱內。在體系達到流體動力學平衡後(即開始有流動相流出時)，將待分離的樣品注入體系。進樣時，將樣品組分溶於一定體積的的流動相之中，其組分將依據其在兩相中分配係數的不同實現分離。同時，在注入固定相和流動相前，需配製溶劑系統，充分振盪後靜置過夜；分離上下層溶劑，超聲排氣30min。而測試結束後用氮氣將固定相推出, 可測得保留率，有時由於固定相的流失導致流出液乳化，一般要求固定相的保留值大於50%。
影響因素
由於高速逆流色譜是無需任何固態載體支撐的液-液色譜,其中作為固定相的液體在色譜柱中的保留程度對於高速逆流色譜的分離過程是十分重要。首先，所選擇的溶劑體系對固定相保留率有很大的影響，如兩相密度差、粘度、界面張力等。兩相的密度差對固定相保留率的影響最大，固定相保留率和密度差基本呈線性關係。其次，還存在一些人為可以操控的條件會對固定相保留率產生影響，如高速逆流色譜的轉速、流速、以及柱溫等。其中，螺旋管柱的轉速以及它產生的離心力場對兩相的混合程度具有決定性的影響。因此，對於界面張力較高的溶劑系統，應使用較高的轉速，以使兩相之間能夠劇烈的混合，從而促進分配和減少質點傳遞的阻力。對於界面張力較低的溶劑系統，應使用較低的轉速，以避免過分混合引起乳化作用，以及固定相的流失。
在流動相流速方面，固定相保留率與流速平方根之間有著線性關係。流動相流速快不利於固定相的保留，且出峰時間太快會導致峰與峰間的分離度較差，而低流速雖然可以滿足提高固相保留率的要求，但是分離時洗脫時間太長，且峰形變寬、耗費大量的流動相，故選擇合適的流速對整個分離體系非常重要。
儀器的柱溫對固定相的保留同樣也有著不可忽視的作用，其溫度對於親水性強的正丁醇溶劑體系的固定相保留率影響較大。同時溫度升高能改變溶劑的粘度，進而影響兩相的分層時間。
在選定了溶劑體系後, 有時需要對三個儀器運行參數(轉速, 流動相流速, 進樣體積)進行正交試驗, 以確定最佳分離條件。分離是一種較為複雜的動態高速分配過程，其分離效率不僅和溶劑系統有關，還受分離溫度、螺旋管轉速、流動相流速、梯度洗脫模式及進樣量、進樣方式等因素的影響。
套用
主要套用於天然藥用植物活性成分的分離、標準品的製備、快速分離和重要指紋圖譜分析以及天然新藥的研發和篩選，HSCCC技術在天然產物分離中有著非常廣泛的套用 。
