基本原理
轉座子標籤(transposon tagging)技術是研究功能基因的有效的工具之一。轉座子標籤技術克隆基因的基本原理:
轉座子是染色體上一段可移動的DNA片段,它可從染色體的一個位置跳到另一個位置。當轉座子跳躍而插入到某個功能基因時,就會引起該基因的失活,並誘導產生突變型,而當轉座子再次轉座或切離這一位點時,失活基因的功能又可得一恢復。遺傳分析可確定某基因的突變是否由轉座子引起。由轉座子引起的突變便可以轉座子DNA為探針,從突變株的基因組文庫中釣出含該轉座子的DNA片段。並獲得含有部分突變株DNA序列的克隆,進而以該DNA為探針。篩選野生型的基因組文庫,最終得到完整的基因。
理論發展
轉座子標籤法不但可以通過上述轉座突變分離基因,而且當轉座子作為外源基因通過農桿菌介導等方法導入植物時,還會由於T-DNA整合到染色體中引起插入突變,並進而分離基因,因此大大提高了分離基因的效率。轉座子標籤法的主要步驟是:(1)採取農桿菌介導等適當的轉化方法把轉座子導入目標生物體,(2)轉座子在目標生物體內的初步定位,(3)轉座子插入突變的鑑定及分離,(4)轉座子在目標生物體內的活動性能檢測,(5)對轉座子插入引起的突變體,利用轉座子序列作探針,分離克隆目的基因。
套用實例
1938年細胞遺傳學家McClintock首先在玉米中發現了可自主移動的DNA片段,並命名為轉座子,後來又陸續在細菌、酵母、果蠅、金魚草和擬南芥等其他植物中發現了內源轉座子。說明轉座子廣泛存在於從原核細菌到真核的高等動植株的細胞中。轉座子分為兩類:逆轉座子(Ⅰ類因子)和轉座子(Ⅱ類因子)。逆轉座子首先在動物和酵母菌基因組中發現,但許多證據已表明它們幾乎存在於苔蘚、石松、蕨類、裸子植物和被子植物等所有植物的基因組中,並且是植物基因組中一個很大的組成部分。逆轉座子的增殖以RNA為中介,且拷貝數較多。研究表明,逆轉座子在很大程度上是侵略性的,通常情況下逆轉座子被嚴格控制,但在脅迫條件下,逆轉座子可被激活。果蠅和酵母的逆轉座子在正常的生命周期中就具活性,菸草逆轉座子Tntl也可在擬南芥中轉座;1999年Sato等人利用Hirchick建立的水稻逆轉座子Tos17基因敲除體系分離了6個水稻knl-型同源異型框基因,發現了引起水稻植株矮化的突變基因OSH15。Ⅱ類因子(即通常所說的轉座子)只通過由DNA到DNA的方式增殖,包括細菌的插入序列(insertion sequence);複合轉座成分(composite transopson);Tn轉座家族(Tn family);可轉移噬體(transposable phages);酵母的Ty(transposable element in yeast);果蠅的copia等轉座子成分及高等植物的轉座子。目前研究得比較清楚且套用較多的是玉米的Ac/Ds、Spm/dSpm和金魚草的Tam3轉座子。植物的轉座子,其結構類似於細菌的複合成分,以Ac/Ds為例,Ac全長4.5kb,兩端為11bp反向重複序列,Ds的大小為0.4-4kb,一般認為Ds是Ac缺失的結果,Ac單獨存在便可引起突變,但變異不穩定,Ds在有Ac存在的條件下,才會引起插入突變。