觀察AngⅡ對人心房肌細胞膜鉀電流的作用，揭示其參與房性心律失常的電生理機制，為套用AngⅡ受體拮抗劑治療房性心律失常提供實驗基礎.方法：急性分離單個人心房肌細胞，採用全細胞膜片鉗方法記錄內向整流鉀電流(Ik1)、短暫外向鉀電流（Ito）.實驗分4組：對照組，AngⅡ（01μmol/L）組，替米沙坦（001μmol/L）組，AngⅡ+替米沙坦組.結果：與對照組相比，01μmol/LAngⅡ使人心房肌細胞膜Ito峰值電流密度明顯下降(pA/pF,655±052vs1265±106，P＜001）,在-100ｍＶ電壓下使IK1峰值電流密度顯著升高(pA/pF,-931±102vs-523±098,P<001).0.01μmol/L替米沙坦對人心房肌細胞膜ItoIK1無明顯影響，但可拮抗AngII的作用；AngⅡ+替米沙坦組的Ito峰值電流密度(pA/pF,1174±128)和IK1峰值電流密度(pA/pF,-613±115)與AngⅡ組相比有顯著差別（P＜001）.結論：AngⅡ對人心房肌細胞具有明顯的電生理學作用，01μmol/LAngⅡ可促進人心房肌細胞膜IK1並抑制Ito，替米沙坦可拮抗AngⅡ對人心房肌細胞膜鉀電流的作用.
【關鍵字】替米沙坦;鉀通道；膜片鉗術；心房；肌細胞；血管緊張素Ⅱ
0引言
血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）是腎素血管緊張素系統中的主要活性肽產物，與許多心血管疾病密切相關.近年來發現血管緊張素轉換酶抑制劑具有防治房顫的作用，AngⅡ在心律失常發生中的作用受到關注［1,2］.研究證實AngⅡ不僅可引起室性心律失常，且對心房電重構有促進作用，有利於心房顫動的發生與維持，而AngⅡ受體拮抗劑可抑制心房電重構［3,4］.本實驗旨在通過研究AngⅡ對人單個心房肌細胞鉀離子流的作用，了解其誘發房性心律失常可能的電生理學機制；並觀察替米沙坦（telmisartan）的拮抗作用，為套用AngII受體拮抗劑治療房性心律失常提供實驗基礎.
1材料和方法
11材料
111對象200306/200406西京醫院接受心臟體外循環手術的先天性心臟病患者10（男6，女4）例；平均年齡(148±56)歲.患者皆無持續性房顫病史，無嚴重左室功能不全，2wk未使用過血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑或血管緊張素轉換酶抑制劑.建立體外循環前取右心耳組織，放入氧飽和的4℃心臟停搏液中，5min內送回實驗室.
112溶液成分和試劑①正常Tyrode氏液組成為（mmol/L）：NaCl126、KCl54、MgCl208、CaCl21、NaH2PO4033、Glucose55、hepes10，用NaOH調pH至74.②無鈣Tyrode氏液為上述正常Tyrode氏液中不含CaCl2.③KB液的組成為(mmol/L)：谷氨酸70、KCl0、牛磺酸10、KH2PO410、EGTA10、Glucose10、用KOH調pH至74.④記錄鉀通道電流的電極內液(mmol/L)：KCl140、MgCl205、HEPES10、EGTA10、Na2ATP5.pH用KOH校至72.電極外液：NaCl135、KCl54、CaCl21、MgCl22、HEPES5、Glucose15，pH用NaOH校至74.⑤AngⅡ和替米沙坦的配製：AngⅡ以1mmol/L濃度溶於雙蒸餾水中，分裝後-20℃保存，實驗時以分裝液溶於細胞外液而得到01μmol/L終濃度.替米沙坦結晶粉末幾乎不溶於水和pH39的水溶液.溶液配置方法：稱取替米沙坦52mg，加入60mLDMEM培養基中；用1mol/LNaOH調pH至95,攪拌至藥物完全溶解；再加DMEM培養液至溶液總量為100mL；用1mol/LHCl調pH至74備用.替米沙坦配製濃度為01mmol/L，實驗時終濃度為001μmol/L.實驗所用AngⅡ、膠原酶、蛋白酶、EGTA、HEPES、TTX、CdCl2、4AP為美國Sigma公司產品，DMEM培養基為美國GIBCO公司產品，替米沙坦為江蘇天士力帝益藥業有限公司贈送，其餘為國產分析純.
12方法
121單個人心房肌細胞的分離根據我科實驗室的方法進行［5］.人右心耳標本在氧飽和無鈣台氏液中剪成約01mm×01mm×01mm的組織塊，洗滌；在37℃、磁力攪拌及充氧條件下，用含膠原酶（333mkat/L）、蛋白酶（3334μkat/L）的無鈣台氏液消化15min後，換為含膠原酶333mkat/L的無鈣台氏液進一步消化；5~10min後將組織塊在KB液中輕輕吹打，細胞懸液用200目濾網過濾；細胞在KB液中保存60min後進行電生理記錄.
122實驗分組實驗分4組：對照組；AngⅡ組：以含AngⅡ01μmol/L的電極外液灌流；替米沙坦組：以含替米沙坦001μmol/L的電極外液灌流；AngⅡ+替米沙坦組：電極外液先加替米沙坦001μmol/L，2min後再加AngⅡ01μmol/L.各組皆採用全細胞膜片鉗方法記錄內向整流鉀電流(Ik1)和短暫外向鉀電流（Ito）.
123膜片鉗全細胞記錄取細胞懸液1～2滴，轉入倒置顯微鏡上的自製灌流槽中，室溫下靜置5～10min，使細胞充分貼壁；以正常含鈣10～20mmol/L的台氏液進行灌流，速度為10mL/min.採用兩步拉製法拉制微電極，沖灌電極內液後阻抗4～8MΩ，將電極固定在電極夾持器上與Axon200Ｂ放大器相連，在倒置顯微鏡下找到邊界清楚、紋理清晰、大小適中的細胞；迅速將電極靠近細胞，在液接電位補償後利用負壓抽吸，使形成高阻抗封接；快電容補償後破膜，慢電容補償後即可對細胞進行電壓鉗制，建立全細胞記錄模式.刺激脈衝通過pClamp80軟體控制的Ｄ/Ａ轉換器操縱，記錄的信號經膜片鉗放大器(Axon200B)A/D轉換及2KHz濾波放大後存入計算機硬碟.記錄心肌細胞Ito和IK1及每個細胞電容,計算電流密度(pA/pF)=電流(pA)/電容(pF).
