簡介
腺病毒(Adenovirus)是目前最高效可靠的重組病毒表達系統之一,可用於在哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白。其具備以下優點:
1. 宿主範圍廣。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞,除可感染幾乎所有人的細胞類型外,還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
2. 因腺病毒的感染不依賴細胞周期,故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞。
3. 腺病毒具有嗜上皮細胞特性,因目前大多數腫瘤細胞均屬於上皮細胞,這使得腺病毒非常適合套用於基因治療領域。
4. 病毒滴度高,可用於動物水平的實驗。
5. 有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細胞基因組中;實驗中雖然會有一定機率出現RCA(即複製型腺病毒),但由於大多數成人體內都有針對腺病毒的抗體,所以一般危害不大。
腺病毒包裝技術要點
重組腺病毒的包裝製備:重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位(PFU)中分離獲得的。一個單色斑是線性載體質粒轉染後在20×15 cm板上由293A細胞連續侵染後被挑選和擴增形成的。重組腺病毒可通過超速離心純化,並測定滴度及進行PCR鑑定。純化後重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml,獲得的量為2-4 ml。
重組腺病毒的特性:一般的,單個腺病毒通常是在30×150mm細胞培養皿中製備的。
獲得量:1×10病毒顆粒/細胞
滴定濃度:1×1010~1×1012個病毒基因組/ml
最終體積:1 ml純化後的病毒液(儲存於PBS)
儲存:批量儲存的最佳條件為-80°C
表一 腺病毒表達系統與慢病毒表達系統的比較
病毒表達系統 | 腺病毒表達系統 | 慢病毒表達系統 |
病毒基因組 | 雙鏈DNA病毒 | RNA病毒 |
複製 | 自主複製 | 自主複製 |
感染細胞類型 | 感染分裂和不分裂細胞; 嗜上皮細胞(大多數腫瘤細胞均為上皮細胞) | 感染分裂和不分裂細胞,適合難轉染的原代細胞(如神經細胞)及體內實驗 |
表達方式 | 瞬時表達 | 長時間、穩定表達 |
表達時間 | 快(1~2天) | 慢(1~3天) |
表達豐度 | 高水平表達 | 中水平表達 |
滴度 | 高達10~10 pfu/ml | 最高可達10~10 pfu/ml |
克隆容量 | 8~40 kb | 8 kb |
免疫原性 | 高免疫原性 | 低免疫原性 |
生物安全性 | 不整合;有一定機率出現RCA;大多數成人有抗體 | 整合;有一定機率出現RCL |