腦康靈口服液是由天麻、當歸、川芎、丹參、地龍、鉤藤等組成，臨床用於治療顱腦外傷引起的頭痛、頭暈、噁心、嘔吐等。，國內外學者對偏頭痛發病機制分別從血管、神經、免疫、基因表達及微量元素等方面進行了研究，取得了可喜的成果，但有些問題還需要進一步探討。為此，本文採用透射電鏡和流式細胞儀技術在腦康靈口服液（naokang ling oral liquid，NKL）對硝酸甘油型偏頭痛大鼠神經細胞形態學、凋亡情況、凋亡率及凋亡峰等方面的影響進行了研究。
腦康靈口服液 1 材料
1.1 藥物 NKL口服液，由本院藥劑科提供。麥角胺咖啡因片（cafergot，CFG），每片含酒石酸麥角胺1mg（由上海信誼藥業有限公司生產，生產批號:000401）。硝酸甘油注射液（nitroglycerininjection，NTG）每1ml含硝酸甘油5mg（由廣州明興製藥廠生產，生產批號:000505）。實驗時用注射用水配製成所需濃度。
1.2 試劑 碘化丙啶（PI），Sigma公司;RNaseA，QIAGEM公司;TritoX-100，E.MERCK公司;其餘試劑均為市售分析純。
1.3 儀器 LKBⅢ型超薄切片機（瑞典）;日立H-600型透射電鏡（日本）;COULTERESP型流式細胞儀（美國）。
1.4 動物 SD大鼠，體重250～280g，由西安醫科大學實驗動物中心提供（醫動字第8-005號）。
2 方法
2.1 樣品製備 取健康SD大鼠48隻，雌雄各半。隨機6組，即正常組、模型組、CFG組、NKL3劑量組，每組8隻。參照Cristina、Tassorelli等 ［1，2］ 報導的方法，複製硝酸甘油型SD大鼠偏頭痛動物模型。除正常組外，其餘各組動物sc硝酸甘油注射液10mg/kg。造模30min後按每組ig給藥。正常組不作處理，模型組ig注射用水10ml/kg，CFG組ig CFG藥液10ml/kg，NKL3個劑量組分別ig相應濃度的NKL藥液10ml/kg。造模4h每隻大鼠ip40mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉。儘量放血，斷頭，剪開顱骨，取出腦組織，除去腦膜和血管。每隻大鼠均取同一部位的腦組織塊（大腦皮層部位），備用。
2.2 凋亡細胞形態學觀察 ［3］ 取健康SD大鼠36隻，雌雄各半，隨機分為6組，每組6隻。樣品製備方法同2.1。將取材的新鮮腦組織塊，加入3%戊二醛中，固定30min，用0.1mmol/L PBS漂洗，1%鋨酸溶液固定30min，梯度丙酮脫水，環氧樹脂Epon812滲透包埋，70℃過夜聚合;LKBⅢ型超薄切片機切片，切片厚度為60nm;醋酸雙氧鈾—枸櫞酸鉛雙重染色;日立H-600型透射電鏡觀察攝影。觀察區域有暗細胞（系凋亡前細胞）、凋亡細胞和凋亡小體者，均屬於大腦皮層神經元發生凋亡。記錄神經細胞發生凋亡的動物例數，並對各實驗組動物神經細胞凋亡發生率進行統計分析。質反應資料採用χ 2 檢驗分析，其中，χ 2 >6.635時，P<0.01;χ 2 >3.841時，P<0.05;χ 2 <3.841時，P>0.05。實驗結果由正常組與模型組比較、給藥組與模型組比較中得出。
2.3 凋亡細胞計數 ［4］ 取健康SD大鼠48隻，雌雄各半，隨機分為6組，每組8隻。樣品製備方法同2.1項。將取材的新鮮腦組織塊用PBS液漂洗，用剪刀剪碎成1mm 3 大小的碎塊，加入適量0.5%TritonX-100裂解組織後，收集細胞懸液，1000r/min離心10min棄上清液。細胞用0.1mmol/L磷酸鹽緩衝液（pH7.4）洗2次並懸浮之，加入終濃度為50mg/L的RNAseA，37℃恆浴1h，再加入PI染液至終濃度50mg/L。搖勻後4℃避光靜置1h，經尼龍網過濾，調整細胞濃度為1×10 6 個/ml。在COULTER ESP型流式細胞儀上計數10000個細胞，氬離子激發光波長為488nm，測定各期細胞DNA含量、凋亡峰，並計算凋亡細胞百分率。
2.4 統計學處理計量資料實驗數據採用SPSS9.0統計軟體對實驗數據進行處理。實驗結果由模型組和正常組進行比較，各給藥組與模型組進行比較中得出。
3 結果
3.1 動物行為變化 除正常組外，其餘各組動物給予硝酸甘油30min左右，均出現雙耳發紅、前肢頻繁搔頭、煩躁不安等現象。模型組SD大鼠該現象持續約3h，繼而出現蜷臥、活動減少等狀態;給予NKL藥液後，該現象逐漸消失，趨於正常。提示，硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠有頭部不適表現，而NKL對其有逆轉作用。
3.2 NKL對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞形態的影響 日立H-600型透射電鏡下觀察:正常組SD大鼠大腦皮層神經細胞形態正常;模型組SD大鼠大腦皮層神經細胞可見核固縮變小、核內異染色質增多、核膜皺縮不平、線粒體和粗面內質網均輕度腫脹等改變;給予NKL藥液後，僅11.56g（相當於原生藥）/kg劑量可使硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠大腦皮層神經細胞微觀形態改變程度減輕，基本趨於正常，而5.82、3.62g（相當於原生藥）/kg的NKL藥液對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠大腦皮層神經細胞微觀形態改變無明顯作用。從表1可以看出，給予硝酸甘油後，SD大鼠大腦皮層神經細胞可發生凋亡，模型組6例中有5例可見到凋亡細胞或凋亡小體，與正常組比較差異有顯著性P<0.05）;NKL11.56g（相當於原生藥）/kg劑量組SD大鼠未見凋亡細胞，神經細胞超微結構基本正常，與模型組比較P<0.01，而5.82～3.62g（相當於原生藥）/kg2個劑量組SD大鼠有2～3例可見凋亡細胞，與模型組比較差異無顯著性（P>0.05）。結果見表1表1 NKL對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞凋亡發生率的影響 （略）
3.3 NKL對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞凋亡峰的影響 細胞發生凋亡時，會出現胞內DNA含量降低（因此時染色質DNA降解、斷裂成小分子量的片斷而從細胞內擴散出去）及在正常細胞G1峰前面出現一個DNA含量減少 的G1亞峰（Sub-G1Peak）的現象。我們的實驗結果顯示，正常組神經細胞絕數處於G1期，而模型組則表現為凋亡峰增高、細胞凋亡百分率明顯上升，NKL能夠逆轉一現象。
3.4 NKL對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞凋亡的影響 從表2可看出，經硝酸甘油處理後，模型組神經細胞凋亡百分率明顯升高，與正常組比較差異有非常顯著性（P<0.01）。NKL11.56、5.82g（相當於原生藥）/kg劑量組神經細胞凋亡百分率均有不同程度的降低，與模型組比較差異有非常顯著性或差異有顯著性（P<0.01～P<0.05）。而NKL3.62g（相當於原生藥）/kg劑量組僅有改善的趨勢，與模型組比較差異無顯著性（P>0.05）。結果見表2表2 NKL對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞凋亡百分率的影響 （略）
4 討論
細胞凋亡參與多種疾病的病理過程，在神經系統急性損傷如缺血、創傷、癲癇發作以及某些慢性神經性疾病引起的神經元缺失中，均有凋亡機制參與。目前，透射電鏡觀察法是觀察凋亡細胞形態最好的方法。在流式細胞技術中，則以碘化丙啶（PI）為螢光染料測定細胞活力，靈敏度較高，因此，我們在實驗研究中重點採用了這兩種技術。
實驗結果提示，NKL可改善硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞超微結構異常，降低神經細胞凋亡的發生率和百分率。這說明NKL對硝酸甘油型偏頭痛SD大鼠神經細胞凋亡具有較好的抑制作用。
