線粒體電子漏

對線粒體質子漏(proton leak）和電子漏(electron leak）的研究，是從20世紀70年代以來才在生物力能學(Bioenergetics）和自由基生物與醫學(Free Radical Biology and Medicine）領域內開始進行的。生物力能學家通過大量實驗發現，質子漏對機體的基礎代謝率、能量轉移過程的調節和能量分配可能起著重要作用〔1，2〕。自由基生物學家發現線粒體電子傳遞過程中電子漏所產生的氧自由基，是一類活性極強的物質，對組織、細胞具有較強的損傷性。它在生物衰老、疾病發生髮展(如腫瘤、心肌梗塞、炎症等)及細胞程式死亡中起著極為重要的作用〔3，5〕。對質子漏及電子漏的研究在其它學科尤其是運動科學中尚未涉及。所以研究運動與線粒體質子漏及電子漏之間的關係，是一個很值得探討的課題。
1 線粒體質子漏
1.1 質子漏的發現與概念
Nicolls於1974年在觀察鼠肝線粒體的ΔP(質子電化學勢能)與4態呼吸(線粒體呼吸底物耗盡時緩慢攝氧)速度的關係時發現：在ΔP達到一定數值以後，呼吸速度與ΔP之間呈非線性關係。4態呼吸對ΔP建立的貢獻，在高ΔP時遠小於低ΔP時。從而提示，在高ΔP時，有相當一部分已建立的ΔP被消耗掉了〔6〕。Nicolls認為，在高ΔP時，線粒體內膜的質子導性(proton conduction）增加了。內膜在此時表現為非歐姆特性的導體。也就是說，在高ΔP條件下，線粒體內膜允許已被質子泵泵出的質子以某種特殊的機制重新返回基質，而發生質子漏現象，因此使線粒體電子傳遞產生的質子電化學勢能，在此時被質子漏所消耗。
在目前的文獻報導中，已將靜息呼吸狀態(態4)的線粒體內膜在高ΔP時質子導性增加的現象稱為質子漏。Murphy（1989)給質子漏下了這樣的定義：“質子漏是指質子不通過F0F1－ATPase進行ATP合成，而直接通過線粒體內膜回到基質的過程，其結果導致貯存在ΔP中的自由能被消耗”〔2〕。
1.2 質子漏的可能機制
加解偶聯劑到線粒體中可產生典型的質子漏〔7〕，其原因被認為是這些解偶聯劑增加了線粒體內膜的質子導性。在生理條件下，在棕色脂肪組織線粒體中發現了一種增加其線粒體內膜質子導性的解偶聯蛋白或稱產熱蛋白。這種蛋白質與線粒體內膜結合後可轉變為有效的質子漏，這個漏可能是個氫離子通道〔8〕。上述過程可以消耗由游離脂肪酸氧化所產生的ΔP，並以熱的形式釋放自由能。解偶聯蛋白通道的開通可使線粒體內膜的質子導性增加20倍。不過，這種解偶聯蛋白在其它組織的線粒體中並未被發現。
除了上述解偶聯蛋白可形成質子漏外，研究者還提出了氫鍵鏈模型〔9〕，電擊穿模型〔10〕，質子移位體理論〔11〕等來解釋質子跨越脂膜漏回基質的機制。我國學者劉樹森提出線粒體態4呼吸中的電子漏產生的超氧陰離子可能作為內源性載體，即電子漏引起質子漏〔12〕。
總之，高膜電位時質子導性增強，質子漏回基質現象的發生，可籠統地解釋為是由於高ΔP改變了質子跨膜勢能障礙所致，但其分子機制並不清楚。
1.3 質子漏的生理意義
Nobes（1990）等人在完整肝細胞中觀察了質子漏在總細胞耗氧所占的比例。他們測出約20～25%的細胞耗氧(或25～30%的線粒體耗氧)，用於驅動線粒體質子漏而產熱，質子漏的耗氧量占線粒體總耗氧量的1／4～1／3〔13〕。
從能量轉換的意義上來看，ΔP與4態呼吸速率之間的非線性關係，在由底物自由能轉化為ΔP後，在低ΔP與高ΔP時是不同的，高ΔP時的能量耗散高於低ΔP。在3態呼吸時，能量從ΔP到ΔG(磷酸化勢能)的轉換增加，有利於更多的氧耗被用於ATP的合成。Ernster(1963)發現，增加己糖激酶的量，加快ATP的轉運，也會增加ADP／O比〔14〕，因為加快ATP→ADP的轉化，其結果同樣可以降低ΔP。
較高的ΔP更利於引發質子漏，導致貯於ΔP的自由能以熱的形式釋放。應該認為，在生物體內，這種釋放熱能的形式並非能量的浪費，而可能是具有重要的生理意義：產熱、保持體溫、維持基礎代謝。Brand認為：人體90%的靜態熱產生是來源於只占體重8%的內臟(如：肝、腎、心臟、脾、腸等)，而這些內臟的熱產生可能是來源於其線粒體伴隨氧化磷酸化過程中的質子回漏〔1〕。
雖然直到目前質子漏的生理意義尚未被肯定下來，不過很多的研究者發現，在生理條件下，線粒體質子漏的發生，會使氧化磷酸化得到最優的偶聯繫數，並使產熱和氧化磷酸化這兩個對機體十分重要的過程之間達到精確的平衡〔1，2，15〕。
2 線粒體電子漏
2.1 電子漏的概念及發現
體內大部分的氧耗發生線上粒體細胞色素氧化酶上。一個氧分子在此接受由呼吸鏈傳遞來的4個電子後被還原，並與4個H＋作用生成2個分子水，但在呼吸過程中，線粒體電子傳遞鏈會“漏出”少量的電子直接與氧結合形成超氧自由基(superoxide radical，)，這一現象被稱為線粒體電子漏(electron leak）〔16〕。
隨著對生物體內氧自由基檢測手段的提高，如電子順磁共振(ESR)的套用，人們逐漸發現了線粒體電子漏出的部位、數量及其在各種生理病理條件下的變化〔17，18〕。Loschen（1971）首先證明了線粒體呼吸鏈產生氧自由基〔19〕。Turrens等人(1980)發現線粒體中H2O2主要來自的歧化〔20〕。不同組織分離的線粒體在代謝過程中，都不同程度地檢測到有的存在，因此線粒體已被肯定地認為是產生的重要場所〔18〕。
2.2 電子漏的可能部位
線粒體內膜呼吸鏈上的4個複合物中，複合物Ⅰ和Ⅲ被認為是電子漏產生的主要部位〔20〕。在生理條件下，複合物Ⅰ產生電子漏總量的2／3，複合物Ⅲ產生總量的1／3〔17，20〕。一般認為，細胞色素氧化酶能夠將反應過程中產生的氧的中間產物——氧自由基牢固地結合在蛋白質上，而不游離到周圍的環境中〔16〕。不過，在特定的條件下，如Ksenzenko(1992)用ESR檢測發現，在H2O2存在時，細胞色素氧化酶可能催化H2O2產生〔21〕。徐建興(1995)觀察到外加H2O2濃度低於10－7M(接近生理濃度)時，仍可觀察到電子通過細胞色素C直接傳遞給H2O2的現象。認為在細胞色素C處也存在一個電子漏，這個電子漏可能起著生理上清除和H2O2的作用〔22〕。
電子是如何從呼吸鏈漏出的，機制尚不清楚。有人認為從泛半醌(Ubisemiquione，QH*)自氧化生成〔23〕，也有人認為由還原性細胞色素的自氧化產生電子漏〔24〕。無論電子漏是由於泛半醌，還是由於還原型細胞色素的自氧化形成的，這兩個電子傳遞體都具有較高的還原勢能，都位於線粒體內膜的胞漿一側。因此，從它們對產生的貢獻來看，其機制可能是相似的。
2.3 電子漏的生理意義
目前，對於電子漏現象產生的線上粒體中的作用，報導最多的是關於它對生物體的損傷作用，如的進一步轉化導致脂膜的過氧化，蛋白質的交聯，核酸的破壞等等〔16〕。而對產生與存在的生理意義報導極少。但已有人觀察到炎症反應時在中性白細胞中產生的有抵抗細菌、病毒的生理作用〔25〕。這些在細胞水平上觀察到的的生理意義提示我們，線上粒體中，經長期進化後，依然有少量可躲避SOD的作用而存在著，勢必有其特殊的意義。
3 電子漏與質子漏的相互作用
劉樹森等(1995)提出了電子漏導致質子漏的假想模型〔12，26〕，其理論為：電子漏與質子漏是線粒體電子流與質子流這一能量轉換基本反應相伴隨的過程，電子傳遞和質子轉移相偶聯建立ΔΨ和ΔpH，ΔΨ的高電位可能是導致電子漏產生的條件，從而緩衝由於高ΔΨ所造成的電子傳遞障礙；而ΔpH的建立使膜表面pH下降，與質子結合形成易透膜的HO2*。HO2*可能作為體內的質子移位體，通過pH依賴的質子轉運過程，將質子從內膜外側轉移到內側，從而為質子漏提供條件以維持態4呼吸再循環，二者共同分配和調節ΔP以保持ATP合成與ΔP耗能產熱之間的平衡。
4 運動與質子漏、電子漏的關係
按照Mitchell的化學滲透學說，線粒體通過電子傳遞和耗氧，建立跨線粒體內膜的質子電化學梯度，用於驅動ATP合成〔27〕。當高能質子由F0F1－ATPase複合體重新進入線粒體基質時，能量轉化合成ATP。若線粒體內膜通透性改變時，質子可由非特異性部位滲漏回基質，即形成質子漏時，ADP／O將降低〔28〕。有假說認為：在運動時，由於體溫升高，將增加質子通過線粒體內膜的特異性滲漏〔29〕。Brooks等人(1971)發現在寡黴素(質子通過F0F1－ATPase複合體的阻滯劑)存在的情況下，溫度升高，線粒體態4呼吸耗氧也增加〔30〕。Kozlowski等人(1985)〔31〕報導高熱可降低運動狗的能量態(energy state）。ATP需求一定時，能量態降低說明化學滲透質子環中存在短循環(質子漏)〔28〕。Willis等人(1994)觀察到當溫度從37℃升高到40℃時，線粒體ADP／O比下降10%〔29〕。朱麗萍等人也觀察到隨溫度升高質子漏增加，30℃以上時增加更快〔32〕。
Klug等人(1980)觀察到大鼠耗竭性跑台跑後，以琥珀酸為底物啟動的肝臟線粒體態4呼吸明顯增加，這直接表明耗竭運動可導致肝臟質子漏增多〔33〕。其原因除了溫度影響之外，運動性內源自由基及線粒體鈣反常應該起著很重要的作用。
運動可導致自由基生成增多及線粒體鈣反常〔34，35〕。自由基及其引發的脂質過氧化反應可對線粒體膜造成多方面的損傷，如攻擊膜蛋白和脂類，改變多種膜蛋白的脂微環境，使膜流動性下降，通透性增加〔36〕，這顯然會導致非特異性質子滲漏的增多。線粒體鈣反常也會損傷線粒體膜，如Ca2＋可激活PLA2，使膜脂降解〔37〕，其產物FFA、溶血磷脂又會產生類似去垢劑樣作用，從而使線粒體內膜通透性改變，推測也會導致質子漏形成。
雖然有大量實驗結果表明運動後線粒體膜受到損害，但仍缺乏足夠證據說明質子漏形成增加是運動後線粒體ADP／O比降低，ATP合成減少的原因。
從Davies等人(1982)〔38〕首次用ESR捕捉到急性耗竭運動大鼠肝臟、骨骼肌的自由基信號後，運動性內源自由基生成增多已為國內外大量研究所證實。運動性內源自由基的產生目前認為有兩條途徑：黃嘌呤氧化酶途徑和線粒體呼吸鏈途徑〔39〕。電子傳遞過程中電子漏形成的是自由基的重要來源。由於運動時耗氧劇增，而超氧自由基生成與線粒體氧利用率成正比〔23〕，故推測電子漏所形成的自由基在運動性內源自由基中應占相當比例。從目前對運動後自由基的ESR檢測來看，都是觀察肌肉或肝臟勻漿，沒有能夠對線粒體直接觀察，所以，在對運動性內源自由基形成的貢獻上兩條途徑孰重孰輕，尚需進一步研究。
由於缺血—再灌注損傷與運動性脂質過氧化損傷機制相似，因此有關缺血—再灌注的研究或許對運動導致線粒體損傷的問題有所裨益。張樺等(1993)觀察到心肌缺血—再灌注後質子轉位發生變化，呼吸鏈複合物Ⅰ和Ⅲ複合物的H＋／2e比下降〔40〕。H＋／2e直接反映了線粒體能量轉換的情況〔41〕。H＋／2e下降說明缺血—再灌注的鼠心肌線粒體能量轉換的偶聯程度下降。其原因可能是由於質子回漏增加或電子傳遞與質子泵出發生脫偶聯所導致的。劉樹森的研究表明這種偶聯下降可能是由於電子漏產生的引起的〔12〕。
綜上所述，線粒體質子漏與電子漏可能通過對線粒體能量轉換過程及膜結構的影響，而在運動性線粒體功能下降中起著重要作用。但迄今為止，仍缺乏直接的實驗證據。此外，運動中線粒體質子漏、電子漏的產生是否還有其它積極的生理意義，如質子漏是否可通過調節產熱和氧化磷酸化平衡，起到保護性抑制作用等等，都值得進一步的研究。