組織化學是指以常用的組織化學技術,對細胞內主要化學成分和活性的粗略(一般性)的研究.
概要介紹如下:
一,______核酸(DNA和RNA)
(一)__化學特性
1.分布:DNA(細胞核內)
RNA(核仁10%;細胞質-核糖體90%)
2.分子結構:戊糖+磷酸+鹼基
特點:①大量的磷酸基團→酸性
(嗜鹼性的基礎)
②戊糖—被鹽酸水解→醛基
(成為Feulgen法顯示核酸的基礎)
②戊糖—被鹽酸水解→醛基(成為Feulgen法顯示核酸的基礎)
③可以完全水解或部分水解
④可以用RNAase或DNAase消化
[對照實驗(—)]
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(一)__顯示方法
1.福爾根(Feulgen)反應顯示DNA
[原理]在60℃溫度下,將DNA用1N鹽酸水解,DNA雙鏈打開成單鏈,先釋出鹼基,然後脫氧核糖釋出醛基,該醛基與Schiff氏液形成紫紅色沉澱.
[Schiff試劑顯色原理]
鹼性品紅亞硫酸→白亞黃酸
(無色試劑,稱為Schiff試劑)
[方法]
固定劑的選擇可用一般的組織學固定液,常
用Carnoy固定液.
Carnoy固定液:
純酒:氯仿:冰醋酸=6:3:1
(60ml)(30ml)(10ml)
恆冷箱切片機的具體染色步驟如下:
⑴切片固定在冰醋酸與純乙醇(1:3V/V)
中10分鐘.
⑵由乙醇降至蒸餾水中.
⑶用1N鹽酸浸泡.
⑷放入預熱到60℃的1N鹽酸中,留6分鐘.
⑸放入室溫的1N鹽酸中.
⑹放入Schiff液試劑,保持在暗處,60分鐘
⑺用新配製的SO2水浸洗3次(脫掉未反應
的Schiff液).
⑻蒸餾水浸洗淨(必須用蒸餾水→洗淨無色品紅,
否則,殘留試劑→有色品紅).
⑼脫水透明,封固.
結果:核內DNA染為紅紫色.
對照:僅改變第4步為1N鹽酸,室溫15分鐘→(-).
[注意事項]
⑴不用醛類固定劑如Bouin,戊二醛,丙烯醛等.
常用Carnoy液,甲醇等.
⑵控制水解時間,不同的固定劑用不同的時間,
如:Carnoy8分鐘;Genker5分鐘;
Susa18分鐘★最適條件應自行試驗.
⑶控制溫度,一般1N鹽酸60℃;
如果5N鹽酸18～25度.
⑷保證Schiff試劑的純淨度.
⑸SO2要新配製,除去多餘的Schiff液宜用之.
⑹必須對照.
2._顯示核酸的其它方法
⑴Kurnick甲綠Methylgreen顯示DNA法
⑵甲綠派若寧Methygreen-Pyronin顯示DNA和
RNA法
⑶菊花青鉻明礬(GC)顯示核酸法
⑷丫啶橙AcridineOrange顯示DNA和RNA法
⑸核酸提取法
_一,______蛋白質(Protein)
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(一)蛋白質的分子結構
蛋白質的基本單位是胺基酸,肽鍵將不同的胺基酸結合在一起,除氨基和羧基之外,還含有其它基團,如:—羥基,硫氫基,二硫基等.依其結構特點可分為:酸性胺基酸和鹼性胺基酸;芳香族胺基酸:苯丙胺基酸,酪胺基酸;雜環類胺基酸:組胺基酸,色胺基酸,亞胺基酸,脯胺基酸,羥脯胺基酸.
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(二)目前套用
1._用於蛋白質的一般定性
①確定是否為蛋白質
②確定蛋白質的酸鹼性
③顯示蛋白質的特殊基團
2._用於蛋白質功能定性和定位
_(三)染色方法
目前,研究蛋白質功能定性和定位時多用酶
組織化學法,配體—受體結合法,免疫組化法以
顯示特殊的蛋白質.這裡僅介紹一般的染色方法.
1.四氮化聯鄰茴香胺法
(Tetra-azotized-o-anisidine)
[套用]廣泛套用於顯示酶的活性
[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在低溫下(<
5℃)可生成重氮鹽,此即重氮反應.重氮鹽可
與酚類作用生成有色化合物——偶氮化合物.上
述反應必須在酸性條件下進行.
本實驗,聯鄰茴香胺在酸性,低溫條件
下與亞硝酸作用生成四氮鹽.四氮鹽有兩個
重氮鹽,其中一個重氮基在鹼性條件下與所
要顯示的組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環結
合產生偶聯反應,另一個重氮基與酚類或奈
類發生偶聯反應以增色.因此,可以用生成
的偶氮染料來代表組織細胞的蛋白質含量.
[方法]
1._四氮鹽配製
⑴天平稱取聯鄰茴香胺0.25g(有毒,通
風櫥內進行).
⑵在冰浴下,加入已預冷8%鹽酸10ml,
玻璃攪拌,促其溶解,混合後為懸濁液.
⑶稱NaNO20.15g溶於1ml蒸餾水中(冰浴
下).
⑷在冰浴下,將配好的NaNO2溶液分三次倒入鄰聯茴香胺懸濁液內,每次倒入都須玻棒攪動,因產生NO2可有黃煙冒出,至黃煙停止再倒下一次液體.放入冰櫃(4℃)內,約20分鐘,待溶液變為黃色.
⑸傾出上清液,勿將沉渣泛起,棄去沉渣.
⑹用NaHCO3細粉(約0.5～0.6g)逐漸加
入上清液內,邊加邊攪拌(冰浴下).
⑺以剛果紅試紙測中和點,待試紙不變藍即達到中和.收集於標本瓶(或廣口瓶)內,置冰櫃備用.此液不穩定,置冰櫃內可保存兩周,若變為橘紅色則失效.
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2._偶氮反應
—Carnoy固定的大鼠肝,腸等石蠟切片.
⑴切片脫蠟至水.
⑵將切片放入下列溶液中(在冰浴中至2～3℃),
浸染10分鐘.
用前配製:
四氮化聯鄰茴香胺溶液4ml
0.1巴比妥緩衝液(pH9.2)20ml
24ml
⑶入1N鹽酸(冰浴中2～3℃)浸洗10秒,多餘鹽
酸以濾紙吸乾.
⑷入H酸飽和液,浸染30分鐘(冰浴或冰
箱內).
H酸飽和液配製:H酸0.4g
0.1M巴比妥緩衝液20ml
(pH9.2)過濾後使用!
⑸蒸餾水沖洗,脫水,透明,封固(樹膠)
[結果]
酪氨酸,組氨酸,色氨酸染成紅棕色(+)
※0.1M巴比妥鈉50ml配製
①分析天平稱巴比妥鈉(MW=206.18)
1.0309g
②於量瓶內+蒸餾水50ml至刻度即可.
0.1M巴比妥緩衝液,pH9.2(20ml)配
制:0.1M巴比妥鈉19.1ml
0.1N鹽酸0.9ml
20ml
2.其它的顯示蛋白質的方法
⑴米朗反應(MillonReastion)→顯示酪氨
酸的方法
酪氨酸→羥苯基亞硝酸→亞硝基苯+Hg→有色物
注:膠原蛋白不顯色,其它蛋白質都顯色(+)
⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene(DNFB)法
DNFB與—NH2,SH和酪氨酸產生弱有色反應,
可被偶氮染料加強.
⑶酪氨酸重氮化偶聯反應
⑷蛋白質硫氫基DDD法(固定時避免
氧化劑)
⑸鐵—鐵氰化鉀反應顯示SH基
⑹高甲酸阿爾辛藍顯示SS基法
⑺免疫螢光法顯示蛋白質
三,碳水化合物
中性多糖——糖原
碳水化合物酸性多糖——硫酸軟骨素A,B,
C,肝素,硫酸角
(組織中—多糖類)質素,透明質酸等
蛋白多糖——粘蛋白,唾酸粘蛋白
糖脂——腦苷脂類
※組織中糖的種類較多,因此,要特異性地顯示各種
糖類必須用抑制和酶水解來對照實驗.
本章僅以高碘酸雪夫法(PAS法)說明之,其它的
方法還有Alcianblue法,甲苯胺藍異染性染色法等.
高碘酸雪夫法Periodic—Schiff(PAS)method
[原理]高碘酸為強氧化劑,它可以氧化多糖
分子內1,2—乙二醇(順式和反式)而
產生醛基,此醛基再與Schiff試劑結合即
產生紅紫色.
[方法]改良的McManus(1946),高碘酸雪夫法
標本:
①Carnoy固定的大白鼠肝,腎,腸石蠟切片
②大白鼠肝橫冷箱切片(未固定)
[步驟]
(1)切片脫蠟入水(橫冷箱切片免)
(2)入0.5%高碘酸水溶液,室溫,2～5分鐘
(3)蒸餾水涮洗
(4)入Schiff試劑,洗3次,每次2分鐘
(5)入SO2水中,洗3次,每次2分鐘
(6)自來水洗5～10分鐘
(7)蒸餾水稍洗
(8)入Mayer氏蘇木精副復染核1分鐘
(9)自來水5分鐘,換蒸餾水
(10)脫水,透明,封固
[結果]
PAS(+)→紅紫色或紅色;核→藍色
Carnoy固定,糖原原位定位不佳,有
移位現象.
[對照]
①用唾液酸澱粉於37℃消化20～30分鐘.
②苯甲醯或乙醯化法作對照(抑制法)
[注意事項]
①必須按照規定配方配製試劑,按規定的時間反應.以避免非特異反應.例如:入高碘酸水溶液時間不宜過長,否則非特異著色.
②多糖大多都易溶於水,固定時應避免擴散或移位.
冰凍切片+苦味酸福馬林→固定→避免擴散或移位.
③注意溶液的pH值:高碘酸液的pH不應超過5.
④注意溫度.反應宜在<25℃的室溫下進行,否則可氧化醛基為羧酸.
⑤高碘酸溶液的濃度宜控制在0.5%～1%(0.02—0.1M)濃度過高則會發生非特
異反應.
⑥為充分顯示多糖中的糖原,可在過碘酸
中加入5%醋酸或純乙醇固定,但往往有
溶解和擴散.
⑦為阻止膠原纖維和網狀纖維陽性反應,
可使用還原液,於使用Schiff液之前.
[分析結果]PAS反應陽性物質:糖原,中
性粘蛋白,中性唾液性粘蛋白.
四,脂類
[組織中的脂類]
單純脂類脂肪酸
醇的化合物(如:甘油三脂等)
複合脂類磷脂(卵磷脂,腦磷脂)
脂類鞘磷脂
糖脂(腦苷脂,神經苷脂)
衍生脂類膽固醇
腎上腺素
性激素
[顯示脂類的基本原理]
用易溶於脂類的染料,使之溶於所檢
的脂質(如脂滴)中,使組織內的脂類著色.
[常用方法]
蘇丹黑B法,油紅O法,硫酸尼羅藍法
[基本要求]
⑴不用石蠟切片.
⑵固定劑一般用formalin保存磷脂較好.
⑶方法:
①物理法:脂溶性染料,不溶於水,屬偶
氮染料.常用蘇丹Ⅲ,Ⅳ,蘇
丹黑,油紅O等.
②化學方法:硫酸尼羅藍顯示脂肪酸.
③選擇性提取法(對照)
實驗舉例:蘇丹黑B法
[原理]
蘇丹黑為偶氮染料,具有脂溶性,可
溶於無水酒精,但不溶於水(常用70%酒
精飽和液).當組織切片入染液時,蘇丹
黑B便離開染液而溶於組織內的脂質(如脂
滴中)使組織內脂類著色.
標本:
兔腎上腺和睪丸橫冷箱切片,10μm厚,不
固定(或用10%Formalin固定10分鐘後水洗).
[方法]
①入蒸餾水洗
②於70%乙醇內涮洗
③入蘇丹黑B70%B飽和液,染5～10分鐘
④於50%酒精內浸洗
⑤蒸餾水中洗
⑥入Mayer蘇木精(復染細胞核)1分鐘
⑦自來水沖洗5～10分鐘
⑧入蒸餾水
⑨甘油明膠(或apathy糖膠)封固
[結果]細胞內脂滴均呈黑色
