常規病理
它包括取材、固定、脫水、包埋、切片、染色、封片等幾個主要步驟。
1.取材 此步驟在技術員協助下由病理醫師完成。
2.固定 通過添加固定劑讓組織中的所有細胞及細胞外成分迅速死亡,避免細胞中溶酶體成分的破壞作用,保持離體組織細胞與活組織時的形態相似,並防止細菌繁殖所致的腐敗,以保存蛋白質與核酸的基本結構。病理標本的製作和組織切片都必須先進行固定。常用固定劑:4%甲醛(10%福馬林)水溶液、酒精等。其中福馬林對人體有害。
3.脫水 利用脫水劑將組織內的水分置換出來,以利於有機溶劑的滲入。脫水是否徹底,直接關係到組織是否能充分透明,而脫水過度容易造成組織變脆。目前絕大多數醫院組織脫水都是通過脫水機來完成,按一定的程式來進行,主要試劑為二甲苯和酒精。
4.包埋 用包埋劑來支持組織的過程,最常用的是石蠟包埋法,包埋的關鍵一是平整,二是方位。蠟的熔點應在56-58℃之間。
5.切片 用切片機將包埋有組織的蠟塊切成薄片。切片厚度一般為4-6微米,切片的要求是完整、薄、均勻。
6.染色 未經染色的組織切片和細胞塗片不能直接在光學顯微鏡下觀察。蘇木素和伊紅染色(HE)是細胞與組織學最廣泛的染色方法。
7.封片 切片滴中性樹膠後,加蓋玻片封片。
特殊染色
為了顯示與確定組織或細胞中的正常結構或病理過程中出現的異常物質、病變及病原體等,需要分別選用相應的顯示這些成分的染色方法進行染色。包括:膠原纖維染色(Masson等)、網狀纖維染色、彈力纖維染色、肌肉組織染色(磷鎢酸蘇木素)、脂肪染色(蘇丹III)、糖原染色(PAS)、粘液染色(PAS)等。
細胞製片
細胞製片包括各種來源的樣本的製備,比如宮頸脫落細胞樣本、呼吸系統樣本、體腔液樣本、腦脊液脫落細胞樣本、消化道脫落細胞樣本等的製備;細胞固定;細胞染色等。
免疫組化
免疫組化是套用免疫學基本原理——抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(螢光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質),對其進行定位、定性及定量的方法。免疫組化方法有直接法和間接法;按照標記物的種類可分為免疫螢光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
分子診斷技術
通過從分子水平上完成DNA、RNA或蛋白質檢測,從而對疾病作出診斷的方法稱為分子診斷技術,目前常用的方法有基因診斷和腫瘤標誌物檢測。
1.基因診斷 用分子生物學的理論和技術,通過直接探查基因的存在狀態或缺陷,從基因結構、定位、複製、轉錄或翻譯水平分析基因的功能,從而對人體狀態與疾病作出診斷的方法。基因診斷不僅能對某些疾病作出確切的診斷,如確定某些遺傳病,也能確定基因與疾病有關聯的狀態,如對疾病的易感性、發病類型和階段的確定等。基因診斷的主要技術有核酸分子雜交(原位雜交、southern雜交、Northern雜交、斑點雜交等)、PCR和生物晶片技術。
2.腫瘤標誌物檢測 是指腫瘤細胞和組織由於相關基因或異常結構的相關基因的表達所產生的蛋白質和生物活性物質,在正常組織中不產生或產量甚微,而在腫瘤病人組織、體液和排泄物中可檢測到。此外,在病人機體中,由於腫瘤組織浸潤正常組織,引起機體免疫功能和代謝異常,產生一些生物活性物質和因子,雖然這些物質和因子特異性低,但與腫瘤發生和發展有關,也可用於腫瘤輔助診斷。腫瘤標誌物分別有:原位性腫瘤相關物質、異位性腫瘤相關物質、胎盤和胎兒性腫瘤相關物質、病毒性腫瘤相關物質,癌基因、抑癌基因及其產物等。腫瘤標誌物測定方法包括:生物化學法、免疫組化法、單克隆抗體法。
電鏡技術
由於電鏡產生的電子束穿透能力很弱,必須把標本切成厚度小於0.1微米以下的薄片才能適用,這種薄片稱為超薄切片,切片的製作過程基本上和石蠟切片相似。組織從生物活體取下以後,如果不立即進行適當處理,會由於細胞內部各種酶的作用,出現細胞自溶現象,容易出現人為假象,此外,還可能由於組織乾燥脫水、微生物污染等使細胞的超微結構受破壞。因此標本取材時必須要做到快、小、冷、準等四大基本要求。電鏡分透射電鏡和掃描電鏡,兩者標本的製備各有不同。