1860年(萬延元年)3月3日,在櫻田門(江戶城的內城門之一)外,入朝理事的大老井伊直弼途中受到水戶、薩摩志士十八人的襲擊而被暗殺的事件。
安政大獄發生以後，激起反對派(尊王攘夷派)的憤怒，使以前未成熟的除奸計畫具體化，最後促成行刺大老井伊直弼的壯舉。志士高橋多一郎、金子孫二郎、關鐵之介等水戶藩激進派領袖先後潛人江戶，準備先殺死井伊直弼，再燒掉橫濱外國人的商館，然後等待薩摩藩3000人馬進京，東西呼應，一舉推翻幕府。於是參加除奸計畫的志士陸續趕到江戶。
萬延元年(1860)3月1日，金子孫二郎、木村權之衛門、齋藤監物、稻田重藏、佐藤鐵三郎、關鐵之介和有村雄助等，在日本橋西岸的“一料亭”匯合，商議行刺井伊直死的方案。即乘3月3日的上巳住節井伊大老在櫻田門外登城時襲擊，以四五人為一組，靠近大老的隊伍，先使先頭隊伍混亂而迫近大老，然後下手，誓必取其首級。行刺時如受重傷即自殺，或到老中家自首，其他人全部浴行京都，在當地參加義舉。晚上，關鐵之介、木村權之衛門、野村伊之介、佐野竹之介等19個同志在品川的酒樓“相模屋”設宴訣別。
此時井伊家的近衛家臣已有充分的戒心，矢田藩主松平信和到外櫻田邱宅拜見直弼，評述水戶藩的形勢，勸告立即辭去大老職務，否則性命難保。直弼謝絕他的忠告，深深感到迫於國家形勢，不能計較個人安危，便回答說：“人各有天命，刺客果要殺我，縱然如何戒心也有隙可乘。”松平信和最後告誡要增加衛士，但直弼沒有如此做，因為衛士的人數是幕府規定的，不能隨便增加。
萬延元年(1860)3月3日那天，從早晨起就下雪了，這在春季是少有的天氣。今天井伊直弼登城是為了陳述上巳佳節的祝賀詞。上午9點，直弼在60 多人的武裝部隊的保護下，從外櫻田的職宅出發，當隊伍經過外櫻田門外的桿築藩邱門前的時候，突然有一群人攔轎告狀。其中有一人拿著訴狀，供頭日下部三郎右衛門和供目付澤村軍六正要接近拿狀紙的人，不料日下部三郎右衛門額上中了一刀倒下，澤村也戰死。在此稍前，另外一群志士襲擊槍付加田九郎太，要想奪槍。衛士們因前衛被襲，要想離開轎子上前防衛。正在此時，一聲槍響，一大群人從道路兩邊一齊向轎子衝過來，供目付何西忠左衛門奮戰而死，其他衛士有的受傷有的逃走。
有一名志士乘轎邊無人阻擋，揮刀向轎中刺去，接著就打開轎門將大老直弼拖出來，一刀取下首級，疾呼一聲，向日比谷門而去。此時小河原秀之遠負傷昏倒在地，被志士的呼聲喚醒，發覺主君的首級已被取去，立即追上前去。追至長州藩邱前面，從背後向那志士砍去，將他砍傷，自己卻被那志士返身過來再次砍倒。原來取下直弼首級的是薩州脫藩志士有村次左衛門，他被小河原砍中以後傷勢甚重，自知性命難保，在辰之口的若年寄遠藤風統邸宅前放下直弼的首級，切腹而死。據一般說法，打手槍的是現場總指揮關鐵之介。
這次事件史稱“櫻田門事變”，井伊家的衛士被當場打死的有河西忠左衛門、澤村軍六、加田九郎太、水田太郎兵衛四人，重傷後死的有日下部三郎右衛門、小河原秀之遠、岩崎德之進、越石源次郎四人，其他負傷的有十多人。
參加行刺大老的志土有水戶藩脫藩士關鐵之介、稻田重藏、山口辰之介、鯉淵要人；廣岡子之次郎、黑澤忠三郎、佐野竹之介、杉山孫一郎、岡部三十部、廣木松之介、增子金八、齋藤監物、蓮田市五郎、森五六郎、森山繁之介、大關和七郎、海後磋礬之介，以及薩州藩的有村次左衛門，共18人。
三月晦日，免去直弼的大老職務。閏三月晦日，井伊家發喪。4月9日從外櫻田的井伊邸宅出棺，10月葬於茬原郡世田谷村的菩提寺豪德院，說號為宗觀院柳曉覺翁。
安政大獄鎮壓志士引起的反感都集中到井伊身上，井伊遂被用來進行血祭，志士們的行動未必就是反幕運動。但是在光天化日之下，握有幕府實權的大老遭到暗殺這件事，就成了幕府權力衰退的轉機。據水戶浪士報告當時情況的信中說道：“隨同入城的旗本們一下子東逃西散，看熱鬧的人集如山，有的說‘這大概報了仇’，有的說‘活該’，江戶人的薄情寡義真令人吃驚。”岩倉具視也在當時說：“這個事件標誌著幕府權力的衰落。”
司馬遼太郎認為，1860年倒幕運動開始於櫻田門外，水戶、薩摩兩藩浪人刺殺了井伊大老。幕府的崩潰，就是自櫻田門外開始的。雖然可以斷言暗殺這種政治行徑在歷史上幾乎從來沒有產生過積極的效果，但這次事變則可以說是一個例外。如果肯定明治維新，就應肯定作為其開端的這次事變。被殺的幕府大老井伊直弼就因為被殺才結束了他最重要的歷史使命。近江彥根藩三百年來被稱為幕府的精華和柱石，但它卻被闖進來的十幾個浪人打得一敗塗地，這給立志推翻幕府的志士們帶來了鼓舞和勇氣，正是這種力量促進了維新的到來，在這一事變中死去的水薩志士，死得都不是輕如鴻毛。
一般學者認為，櫻田門事變是明治維新的導火線。
