分類
色譜法按固定的狀態可分為柱色譜.平板色譜和棒色譜三種而實驗室中最常用的是柱層析和薄層層析，以及它們之間的配合套用。
.吸附柱色譜
吸附色譜的原理：在一定條件下，矽膠與被分離物質之間產生作用，這種作用主要是物理和化學作用兩種.物理作用來自於矽膠表表面與溶質分子之間的范德華力.化學作用主要是矽膠表面的矽羥基與待分離物質之間的氫鍵作用。色譜管為內徑均勻、下端縮口的硬質玻璃管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內裝入吸附劑。吸附劑的顆粒應儘可能保持大小均勻，以保證良好的分離效果。除另有規定外，通常多採用直徑為0.07～0.15mm的顆粒。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時的流速，均按各品種項下的規定。
⑴ 吸附劑的填裝
①乾法 將吸附劑一次加入色譜柱，振動管壁使其均勻下沉，然後沿管壁緩緩加入洗脫劑；或在色譜柱下端出口處連線活塞，加入適量的洗脫劑，鏇開活塞使洗脫劑緩緩滴出，然後自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內形成鬆緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。
②濕法 將吸附劑與洗脫劑混合，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，然後加入洗脫劑將附著管壁的吸附劑洗下，使色譜柱面平整。等到填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下，液面和柱表面相平時，即加供試品液。
⑵ 供試品的加入
除另有規定外，將供試品溶於開始洗脫時使用的洗脫劑中，再沿色譜管壁緩緩加入，注意勿使吸附劑翻起。或將供試品溶於適當的溶劑中，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發去盡使呈鬆散狀，加在已製備好的色譜柱上面。如供試品在常用溶劑中不溶，可將供試品與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻後加入。
⑶ 洗脫
除另有規定外，通常按洗脫劑洗脫能力大小遞增變換洗脫劑的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變洗脫劑的品種和比例。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。
分配柱色譜
方法和吸附柱色譜基本一致。裝柱前，先將載體和固定液混合，然後分次移入色譜柱中並用帶有平面的玻棒壓緊；供試品可溶於固定液，混以少量載體，加在預製好的色譜柱上端。洗脫劑需先加固定液混合使之飽和，以避免洗脫過程中兩相分配的改變。
詳細介紹
柱色譜的概念
柱色譜是在一根玻璃管或金屬管中迸行的色譜技術，將吸附劑填充到管中而使之成為柱狀，這樣的管狀柱稱為吸附色譜柱。使用吸附色譜柱分離混合物的方法，稱為吸附柱色譜。這種方法可以用來分離大多數有機化合物，尤其適合於複雜的天然產物的分離。分離容量從幾毫克到百毫克級，所以，適用於分離和精製較大量的樣品。
吸附柱色譜
在吸附柱色譜中，吸附劑是固定相，洗脫劑是流動相，相當於薄層色譜中的展開劑。吸附劑的基本原理與吸附薄層色譜相同，也是基於各組分與吸附劑間存在的吸附強弱差異，通過使之在柱色譜上反覆進行吸附、解吸、再吸附、再解吸的過程而完成的。所不同的是，在進行柱色譜的過程中，混合樣品一般是加在色譜柱的頂端，流動相從色譜柱頂端流經色譜柱，並不斷地從柱中流出。由於混合樣中的各組分與吸附劑的吸附作用強弱不同，因此各組分隨流動相在柱中的移動速度也不同，最終導致各組分按順序從色譜柱中流出。如果分步接收流出的洗脫液，便可達到混合物分離的目的。一般與吸附劑作用較弱的成分先流出，與吸附作用較強的成分後流出。
吸附劑與洗脫劑
根據待分離組分的結構和性質選擇合適的吸附劑和洗脫劑是分離成敗的關鍵。
1. 吸附劑的要求
一種合適的吸附劑，一般應滿足下列幾個基本要求:
⑴對樣品組分和洗脫劑都不會發生任何化學反應，在洗脫劑中也不會溶解。
⑵對待分離組分能夠進行可逆的吸附，同時具有足夠的吸附力，使組分在固定相與流動相之間能最快地達到平衡。
⑶顆粒形狀均勻，大小適當，以保證洗脫劑能夠以一定的流速 （一般為1.5 mL·min-1）通過色譜柱。
⑷材料易得，價格便宜而且是無色的，以便於觀察。可用於吸附劑的物質有氧化鋁、矽膠、聚醯胺、矽酸鎂、滑石粉、氧化鈣 （鎂）、澱粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。其中有些對幾類物質分離效果較好，而對其它大多數化合物不適用。
2. 幾種常見吸附劑
⑴氧化鋁： 市售的層析用氧化鋁有鹼性、中性和酸性三種類型，粒度規格大多為100~150目。
鹼性氧化鋁 (pH 9-10）適用於鹼性物質 （如胺、生物鹼）和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用於烴類、甾體化合物等中性物質的分離。但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內酯的水解、醇羥基的脫水、乙醯糖的去乙醯化、維生素A和K等的破壞等不良副反應。所以，這些化合物不宜用鹼性氧化鋁分離。
酸性氧化鋁 (pH 3.5-4.5）適用於酸性物質如有機酸、胺基酸等的分離。
中性氧化鋁 (pH 7-7.5）適用於醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在鹼性介質中不穩定的物質如酯、內酯等的分離，也可以用來分離弱的有機酸和鹼等。
⑵矽膠： 矽膠是矽酸的部分脫水後的產物，其成分是SiO2·xH2O，又叫縮水矽酸。柱色譜用矽膠一般不含粘合劑。
⑶聚醯胺： 聚醯胺是聚己內醯胺的簡稱，商業上叫做錦綸、尼龍-6或卡普綸。色譜用聚醯胺是一種白色多孔性非晶形粉末，它是用錦綸絲溶於濃鹽酸中製成的（製法詳見附錄十）。不溶於水和一般有機溶劑，易溶於濃無機酸、酚、甲酸及熱的乙酸、甲醯胺和二甲基甲醯胺中。聚醯胺分子表面的醯氨基和末端胺基可以和酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成強度不等的氫鍵，因此可以分離上述化合物，也可以分離含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。
⑷矽酸鎂： 中性矽酸鎂的吸附特性介於氧化鋁和矽膠之間，主要用於分離甾體化合物和某些糖類衍生物。為了得到中性矽酸鎂，用前先用稀鹽酸，然後用醋酸洗滌，最後用甲醇和蒸餾水徹底洗滌至中性。
3. 吸附劑的活度及其調節
吸附劑的吸附能力常稱為活度或活性。吸附劑的活性取決於它們含水量的多少，活性最強的吸附劑含有最少的水。吸附劑的活性一般分為五級，分別用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V表示。數字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ和Ⅲ。向吸附劑中添加一定的水，可以降低其活性；反之，如果用加熱處理的方法除去吸附劑中的部分水，則可以增加其活性，後者稱為吸附劑的活化。
4.吸附劑和洗脫劑的選擇
樣品在色譜柱中的移動速度和分離效果取決於吸附劑對樣品各組分的吸附能力大小和洗脫劑對各組分的解吸能力大小，因此，吸附劑的選擇和洗脫劑的選擇常常是結合起來進行的。首先，根據待分離物質的分子結構和性質，結合各種吸附劑的特性，初步選擇一種吸附劑。然後根據吸附劑和待分離物質之間的吸附力大小，選擇出認為適宜的洗脫劑。最後，採用薄層色譜法進行試驗。根據試驗結果，再進一步決定是調節吸附劑的活性，還是更換吸附劑的種類，或是改變洗脫劑的極性。直到確定出合適的吸附劑和洗脫劑為止。
物質與吸附劑之間的吸附能力大小既與吸附劑的活性有關，又與物質的分子極性有關。分子極性越強，吸附能力越大，分子中所含極性基團越多，極性基團越大，其吸附能力也就越強。具有下列極性基團的化合物，其吸附能力按下列次序遞增：
-Cl，-Br，-I<-C=C-<-OCH3<-CO2R<-CO-<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-COOH
操作方法
1. 裝柱
色譜柱的大小規格由待分離樣品的量和吸附難易程度來決定。一般柱管的直徑為0.5～l0 cm，長度為直徑的10～40倍。填充吸附劑的量約為樣品重量的20～50倍，柱體高度應占柱管高度的3/4，柱子過於細長或過於粗短都不好。裝柱前，柱子應乾淨、乾燥，並垂直固定在鐵架台上，將少量洗脫劑注入柱內，取一小團玻璃毛或脫脂棉用溶劑潤濕後塞入管中，用一長玻璃棒輕輕送到底部，適當搗壓，趕出棉團中的氣泡，但不能壓得太緊，以免阻礙溶劑暢流 （如管子帶有篩板，則可省略該步操作）。再在上面加入一層約0.5 cm厚的潔淨細砂，從對稱方向輕輕叩擊柱管，使砂面平整。
常用的裝柱方法有乾裝法和濕裝法兩種。
⑴乾裝法：在柱內裝入2/3溶劑，在管口上放一漏斗，打開活塞，讓溶劑慢慢地滴入錐形瓶中，接著把乾吸附劑經漏斗以細流狀傾瀉到管柱內，同時用套在玻璃棒 （或鉛筆等）上的橡皮塞輕輕敲擊管柱，使吸附劑均勻地向下沉降到底部。填充完畢後，用滴管吸取少量溶劑把粘附在管壁上的吸附劑顆粒沖入柱內，繼續敲擊管子直到柱體不再下沉為止。柱面上再加蓋一薄層潔淨細砂，把柱面上液層高度降至0.1～l cm，再把收集的溶劑反覆循環通過柱體幾次，便可得到沉降得較緊密的柱體。
⑵濕裝法：基該方法與乾裝法類似，所不同的是，裝柱前吸附劑需要預先用溶劑調成淤漿狀，在倒入淤漿時，應儘可能連續均勻地一次完成。如果柱子較大，應事先將吸附劑泡在一定量的溶劑中，並充分攪拌後過夜 （排除氣泡），然後再裝。無論是乾裝法，還是濕裝法，裝好的色譜柱應是充填均勻，鬆緊適宜一致，沒有氣泡和裂縫，否則會造成洗脫劑流動不規則而形成“溝流”，引起色譜帶變形，影響分離效果。
2. 加樣
將乾燥待分離固體樣品稱重後，溶解於極性儘可能小的溶劑中使之成為濃溶液。將柱內液面降到與柱面相齊時，關閉柱子。用滴管小心沿色譜柱管壁均勻地加到柱頂上。加完後，用少量溶劑把容器和滴管沖洗淨並全部加到柱內，再用溶劑把粘附在管壁上的樣品溶液淋洗下去。慢慢打開活塞，調整液面和柱面相平為止，關好活塞。如果樣品是液體，可直接加樣。
3. 洗脫與檢測
將選好的洗脫劑沿柱管內壁緩慢地加入柱內，直到充滿為止 （任何時候都不要衝起柱面覆蓋物）。打開活塞，讓洗脫劑慢慢流經柱體，洗脫開始。在洗脫過程中，注意隨時添加洗脫劑，以保持液面的高度恆定，特別應注意不可使柱面暴露於空氣中。在進行大柱洗脫時，可在柱頂上架一個裝有洗脫劑的帶蓋塞的分液漏斗或倒置的長頸燒瓶，讓漏斗頸口浸入柱內液面下，這樣便可以自動加液。如果採用梯度溶劑分段洗脫，則應從極性最小的洗脫劑開始，依次增加極性，並記錄每種溶劑的體積和柱子內滯留的溶劑體積，直到最後一個成分流出為止。洗脫的速度也是影響柱色譜分離效果的一個重要因素。大柱一般調節在每小時流出的毫升數等於柱內吸附劑的克數。中小型柱一般以1～5滴/秒的速度為宜。
洗脫液的收集，有色物質，按色帶分段收集，兩色帶之間要另收集，可能兩組分有重疊。對無色物質的接收，一般採用分等份連續收集，每份流出液的體積毫升數等於吸附劑的克數。若洗脫劑的極性較強，或者各成分結構很相似時，每份收集量就要少一些，具體數額的確定，要通過薄層色譜檢測，視分離情況而定。至2018年，多數用分步接受器自動控制接收。
洗脫完畢，採用薄層色譜法對各收集液進行鑑定，把含相同組分的收集液合併，除去溶劑，便得到各組分的較純樣品。
