抑制性消減雜交技術是一種以抑制性PCR 反應為基礎,將標準化測試cDNA 單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術。通過合成兩個不同的接頭,接於經限制性內切酶消化後的測試cDNA 片段的5’末端,將測試和驅動進行兩輪雜交。所謂抑制性PCR 是利用鏈內退火優於鏈間退火,使非目的序列片段兩端的長反向重複序列在退火時產生“鍋柄樣”結構,無法與引物配對,從而選擇性抑制非目的序列片段擴增。
抑制性消減雜交技術的基本實驗過程如下。首先,將要進行比較的兩種組織或細胞來源的mRNA 樣品反轉錄為cDNA,把含有目的基因的cDNA 稱為測試(tester),把參考cDNA 稱為驅動(driver),用同一種限制性內切酶Rsa I 切割,產生末端平頭的片段,將測試cDNA 分為兩份,每份連線不同的接頭,即接頭1(adaptor 1)和接頭2(adaptor 2)。接頭為雙鏈DNA 片段,且5’- 端均無磷酸基,這樣保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA 的5’- 末端連線,兩個接頭含有可識別的序列. 接下來進行兩次雜交。第一次雜交每個測試里加入過量驅動,然後變性、退火,根據雜交動力學第二定律,即豐度越高的分子退火速度越快,因此測試cDNA與驅動cDNA相同片段大都形成異源雙鏈分子,使得差異表達的單鏈分子得到富集。第二次雜交,將進行過首次雜交的兩組樣品不經變性而直接混合,只有剩下的經過消減並平均化了的差異表達的單鏈cDNA 可以重新結合為新的雜交體分子,這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2,加入新鮮變性的驅動進行第二輪消減雜交,進一步富集差異表達的雜交體分子,並用DNA 酶補平末端,這樣差異表達的測試序列- 雜交體分子5'- 和3'- 端就有了進行巢式PCR 所需的不同的退火位點。最後,進行兩次PCR 反應,第一次PCR 只有兩端連線有不同接頭的雙鏈cDNA 片段才得以指數擴增,而其他形式如一端有接頭,而另一端無接頭的只能線性擴增,沒有引物結合點的不能擴增,還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無法獲得指數擴增。利用巢式引物進行第二次PCR,富集差異表達的基因片段. PCR 產物可以被直接插入T 載體,或者利用接頭1 上的NotI/SmaI/XmaI 位點和接頭2R 上的EagI 位點進行定向克隆,或者接頭與cDNA 連線處的RsaI 位點平端克隆。然後利用測序和雜交分析來分析差異表達的序列,或者用PCR 產物作探針來篩選DNA 文庫。
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