分子熔解增色效應
指變性後DNA 溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子具有吸收250－280nm波長的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中鹼基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎,但雙螺旋結構有序堆積的鹼基又"束縛"了這種作用。變 性DNA 的雙鏈解開,鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收,故而產生增色效應。一般以260nm下的紫外吸收光密度作為觀測此效應的指標,變性後該指標的觀測值通常較變性前有明顯增加, 但不同來源DNA的變化不一,如大腸桿菌DNA經熱變性後,其260nm的光密度值可增加40%以上, 其它不同來源的DNA溶液的增值範圍多在20－30%之間。
以加熱為變性條件時,增色效應與溫度有十分密切的關係,這主要是變性溫度取決於DNA自身的性質。熱變性使DNA分子雙鏈解開所需溫度稱為熔解溫度( melting temperature,簡寫Tm)。因熱變性是在很狹的溫度範圍內突發的躍變過程, 很像結晶達到熔點時的熔化現象,故名熔解溫度。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型。S型曲線下方平坦段,表示DNA的氫鍵未被破壞,待加熱到某一溫度處時,次級鍵突發斷開,DNA迅速解鏈,同時伴隨吸光率急劇上升,此後因"無鏈可解"而出現溫度效應喪失的上方平坦段。Tm定義中包含了使被測DNA的50%發生變性的意義,即增色效應達到一半的溫度作為Tm,它在S型曲線上,相當於吸光率增加的中點處所對應的橫坐標。不同來源DNA間的Tm存在差別,在溶劑相同的前提下,這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質所造成的。(1)DNA的均一性。有二種含義，首先是指DNA分子中鹼基組成的均一性,如人工合成的只含有一種鹼基對的多核苷酸片段,與天然DNA比較,其Tm值範圍就較窄。因前者在變性時的氫鏈斷裂幾乎可"齊同"進行,故所要求的變性溫度更趨於一致。其次還包含有待測樣品DNA的組成是否均一的意思,如樣品中只含有一種病毒DNA,其Tm值範圍較窄, 若混雜有其它來源的DNA,則Tm值範圍較寬。其原因顯然也與DNA的鹼基組成有關。 總的說,DNA均一性,變性的DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近,Tm值範圍較窄,反之亦然。(2)DNA的(G+C)含量。在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決於DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C鹼基對越多,Tm值越高。此點是易於理解的,因G-C鹼基對具有3對氫鍵,而A-T鹼基對只有2對氫鍵,DNA中(G+C)含量高顯然更能增強結構的穩定性,破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其變性Tm也高。實驗說明,Tm與DNA中(G+C)含量存在著密切相關性(圖1-16),從中可看出,變性溫度受到溶液離子強度的影響。Tm與(G+C)含量(X)百分數的這種關係可用以下經驗公式表示(DNA溶於0.2mol/L NaCl中):
DNA的復性
指變性DNA 在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性,此過程稱之為" 退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見後)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡要說明之。
溫度和時間。變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長時間,其吸光率會逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線特徵可以基本恢復到第一次變性曲線的圖形。這表明復性是相當理想的。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運動顯著減弱互補鏈結合的機會自然大大減少。從熱運動的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利於復性。復性時溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是及不可能的,核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利於復性。
DNA濃度。復性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用“成核”。這一過程進行的速度與DNA濃度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合“成核”的機會越大。
DNA順序的複雜性。簡單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時,互補鹼基的配對較易實現。而順序複雜的DNA,如小牛DNA的非重複部分,一般以單拷貝存在於基因組中,這種複雜特定序列要實現互補,顯然要比上述簡單序列困難得多。在核酸復性研究中,定義了一個Cot的術語,(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時間),用以表示復性速度與DNA 順序複雜性的關係。在探討DNA順序對復性速度的影響時,將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)取對數後對Cot作圖,可以得到如圖所示的曲線,用非重複鹼基對數表示核酸分子的複雜性。如多聚(A)的複雜性為1,重複的(ATGC)n組成的多聚體的複雜性為4,分子長度是105核苷對的非重複DNA的複雜性為105。原核生物基因組均為非重複順序,故以非重複核苷酸對表示的複雜性直接與基因組大小成正比,對於真核生物基因組中的非重複片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度,400核苷酸的長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cotl/2),與核苷酸對的複雜性成正比。對於原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的複雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重複序列（repetitive sequence)，所得到的Cot曲線要上圖中的S曲線複雜。
