HRM介紹
高解析度熔解曲線分析（high resolution melting analysis，HRM）是國際上發展的一種新型的檢測單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）及掃描突變的新技術。HRM 無需使用序列特異性探針，而是利用一種飽和染料對 PCR 反應產物進行分析。
基本原理
HRM 的基本原理：雙鏈核苷酸（double strand DNA，dsDNA）的熱穩定性受其長度和鹼基組成的影響，序列變化會導致升溫過程中 dsDNA 解鏈行為的改變。因為所用的螢光染料只能嵌入並結合到dsDNA 上，因此利用實時 PCR 技術，通過實時檢測 dsDNA 熔解過程中螢光信號值的變化，就能以生成不同形狀熔解曲線的方式將 PCR 產物中存在的差異直觀地展示出來。同時，藉助於專業性的分析軟體就可以對測試群體實現基於不同形狀熔解曲線的基因分型或歸類。
技術特點
相對於其它基於 PCR 的 DNA 多態性檢測技術如單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、變性高效液相色譜（denaturing high-performance liquid chromatography，dHPLC）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，HRM 的優勢在於操作簡單，分析時間短，靈敏度和特異性高，PCR 產物無需後處理（如酶切、電泳等），可實現真正的閉管操作從而降低污染風險。另外 HRM 具有高通量的特點，非常適合大量樣品的分析。因此HRM 檢測方法備受關注，並已發展成為 SNP 基因分型、點突變篩查等的重要手段。
常用儀器
常套用於HRM檢測的儀器主要有以下幾種：（1）HR-1是美國Idaho 公司生產的第一種專門套用於HRM 的檢測儀，主要用於基因預編篩查和SNP分析分型。（2）LightScanner，該儀器螢光採集迅速，溫度控制和數據獲取優勢明顯，因此適用於疾病篩查及測序前的大規模突變篩查和基因分型。(3)LightScanner32是Lightcycler PCR儀的功能增強版， 其溫 度控制及螢光檢測的均一性好，可顯著降低實驗誤差。（4）Lightcycler 480是瑞士Roch e公司生產的具有HRM分析功能的板式全自動螢光定量PCR儀，可以做多重PCR檢測分析 及多種探針研究模式分析。（5）Rotor-gene6000是全球第一款成功將qPCR擴增與HRM結合 在一起實現閉管操作的儀器。
套用
SNP分析
不同個體同一條染色體上同一位點的核苷酸序列絕大多數是一致的，當單個核苷酸鹼基不同而導致核酸序列呈包括置換、缺失和插入等多態性時，稱單核苷酸多態性，即SNP。SNP現象在生物體內廣泛存在，它是生物遺傳變異的表現之一，因而SNP對研究人類遺傳和進化具有重要意義。
突變掃描
運用HRM技術可以進行樣本中已知突變位點的檢測、未知新突變位點的鑑定，已知多態位點(如SNPs、短串聯重複序列、微衛星、條形碼序列等)的檢測等。HRM技術已經在人類和動植物遺傳疾病的分子診斷、動植物各類多態位點的鑑定與檢測、動物生產繁殖數量性狀位點的鑑定與檢測等研究領域獲得了套用，並取得了很多新的研究進展。
甲基化研究
DNA 甲基化是發生在DNA鹼基序列上的一種共價修飾。靶序列上甲基基團的存在可以影響轉錄因子的結合，引起轉錄抑制，從而使該基因的表達受到抑制。DNA甲基化是表型遺傳修飾的重要組成部分，在細胞正常功能維持、遺傳印記、胚胎髮育和腫瘤發生中扮演重要角色。HRM技術為DNA甲基化狀態的檢測另闢蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產生的PCR產物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，製作出標準曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例。
基因分型
HRM技術使用了飽和螢光染料和改進的熔解及分析系統，可檢測核酸間的微小差異，其最先被套用於基因的分型試驗。運用該技術進行基因分型較傳統的分型方法（凝膠電泳，高效液相色譜等）具有顯著的優越性，並取得了很多新的研究進展。人β球蛋白的HbC，HbS和HbE 3個基因型在113bp區域中，運用以往的技術很難將它們區分開，Herrmann等[14]套用HRM技術將β球蛋白的3個基因型分別檢測出來。曹春鴿 利用HRM技術，快速靈敏地對64例隨機DNA樣本的 CYP2C 19*2和 CYP2C 19*3 兩個多態性位點進行了基因分型，且HRM方法的分型結果與測序驗證結果完全一致。
序列匹配
有些研究並不需要完全的基因型，而只需知道 DNA 序列是否匹配，例如：組織移植、基因型-表型的相關性和辯證性. 在活器官移植中，需要對 HLA 進行基因分型. 這個主要牽涉到HLA-A，B，C 和 DR 等幾個位點. 當兩個個體的熔解曲線完全相同時就說明 HLA 基因型完全匹配. 通過 1∶1 混合樣品進行熔解曲線分析，如果樣品不是完全匹配的，那么就將形成不同雜合子而改變溶解曲線，由此可以通過這種方法來驗證試驗結果。
定量研究
HRM技術具有高度的靈敏性，能鑑別熔解曲線的微小變化，因此可以用做定量分析。檢測變異分子所占的比例，通常使用的方法為雙脫氧測序法和（解析度下限為20%-30%）和焦磷酸測序法（解析度下限為1%-10%），但這2種方法既費時又費力。Aten等（2008）和Bruder等（2008）成功地運用HRM技術進行了不同等位基因的 定 量 分 析，結果表明HRM技術可以達到12.5%的解析度。
對凝膠電泳的替代
PCR反應和酶切反應結果的檢驗方法是傳統的瓊脂糖凝膠電泳，但這種方法要結合一些有毒染料（如溴化已錠（EB））進行染色，對試驗人員的安全產生潛在的威脅。HRM技術替代瓊脂糖凝膠電泳是一種很好的選擇，通過熔解曲線可以清楚地鑑別反應產物的特異性和濃度大小等。其優點非常明顯，不必使用凝膠基質和有毒染料，後期的數據處理也可以通過分析軟體自動進行，可以加快試驗的速度（核酸熔解的速度遠遠大於瓊脂糖凝膠電泳的速度），且HRM技術不會損害所分析的核酸樣品，仍然可以做凝膠瓊脂糖電泳檢測。
技術展望
HRM技術具有高通量、高靈敏度和特異性、操作簡單靈活、成本低、對DNA分子無損害、閉管操作等諸多優點。在人類疾病的診斷方面，HRM技術必將從試驗研究走向臨床診斷，成為人類分子疾病臨床診斷的新手段。HRM技術具有廣泛的套用前景，尤其是在臨床診斷方面具有相當巨大的發展空間，將會廣泛套用於動植物基因檢測、食品安全、考古等諸多其他領域。
