原理
凱氏定氮法反應式為：蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算係數，即為蛋白質含量。
1.有機物中的氮在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4反應式為：
2NH2(CH2)2COOH+13H2S04＝(NH4)2S04+6C02+12S02+16H22.在凱氏定氮器中與鹼作用，通過蒸餾釋放出NH3，收集於H3BO3溶液中反應式為:
(NH4)2SO4+2NAOH＝2NH3+2H2O+NA2SO4
2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O
3.用已知濃度的HCI標準溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含量，然後乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量
反應式為：
(NH4)2B407+H2S04+5H20＝(NH4)9SO4+4H2BO2
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
試劑
所有試劑均用不含氨的蒸餾水配製。
2.1硫酸銅。
2.2硫酸鉀。
2.3硫酸。
2.42%硼酸溶液。
2.5混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。
2.640%氫氧化鈉溶液。
2.70.05N硫酸標準溶液或0.05N鹽酸標準溶液。
儀器
定氮蒸餾裝置：1.安全管
2.導管
3.汽水分離管
4.樣品入口
5.塞子
6.冷凝管
7.吸收瓶
8.隔熱液套
9.反應管
10.蒸汽發生瓶
操作方法
1、樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液併入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗。
2、裝好定氮裝置，於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
3、想接收瓶內加入10ml2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，並使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，立即將玻璃蓋塞緊，並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺鏇夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。
同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。
計算
X=(（V1-V2）*N*0.014)/(m*（10/100）)+F*100
X：樣品中蛋白質的含量，g；
V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml；
V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積，ml；
N：硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度；
0.014：1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當於氮克數；
m：樣品的質量（體積），g（ml）；
F：氮換算為蛋白質的係數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為5.30。
注意事項
（1）樣品應是均勻的，固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。
（2）樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上，萬一沾附可用少量水衝下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。
（3）消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷後，慢慢加入30%過氧化氫2-3ml，促使氧化。
（4）在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下。使氮有損失。
（5）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。
（6）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。
（7）混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。
（8）氨是否完全蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為鹼性。
（9）吸收葉也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N鹼液滴定，計算時，A為試劑空白消耗鹼液數，B為樣品消耗鹼液數，N為鹼液濃度，其餘均相同。
（10）以硼酸為氨的吸收液，可省去標定鹼液的操作，且硼酸的體積要求並不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。
（11）向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱物，這是由於分解促進鹼與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱。有時銅離子與氨作用，生成深l藍色的結合物[Cu(NH3)4]2+
（12）這種測算方法本質是測出氮的含量，再作蛋白質含量的估算。只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質含量。
