簡介
凝膠電聚焦按形狀分為垂直柱狀和垂直板狀兩種，他們的操作基本上分別與普通垂直柱狀和板狀的凝膠電泳相似。下面以垂直柱狀電聚焦測定蛋白質等電點操作為例，進行簡要敘述。
加樣品
一般加樣品量約為25／A1，比較稀的蛋白質樣品液可直接加在聚丙烯醯胺凝膠溶液中，也可把樣品溶解在10mol／L尿素中(使用變性凝膠系統時)，加在凝膠柱頂部，而後在樣品液上覆蓋一層1％兩性電解質載體，以防酸性或鹼性電極溶液破壞蛋白質。
聚焦時所用的電極液要根據兩性電解質載體的pH值範圍而定。隨後接通電源，使電壓恆定在200V／6cm膠柱。聚焦6～8h，即直接電流恆定在約lmA／管時停止聚焦。
用一般方法從電聚焦完成的玻管中取出膠柱，按下列方法進行固定和染色。
1．氨基黑染色法將膠柱浸入10％三氯乙酸中，每隔2h換1次，共換約10次(若用鏇轉法連續不斷更新此液固定時間可縮短)。隨後把膠柱轉移到含0．5％氨基黑的14％乙酸溶液染色，用5％乙酸溶液脫色，此法優點是靈敏度高，缺點是耗時長。
2．考馬斯亮藍染色法將膠柱浸在12．5％三氯乙酸溶液(4℃)中連續轉動，除去膠中的兩性電解質後，浸入預熱至65℃0．1％考馬斯亮藍固定染色液[考馬斯亮藍R2s。1g，溶於1L三氯乙酸混和液(三氯乙酸150g，磺基水楊酸45g，甲醇375ml，加蒸餾水930m1)]中30min左右，而後用酸性乙醇溶液(乙醇：蒸餾水：冰乙酸＝25；25：8)脫色。此法既快又靈敏。
樣品pH值的測定
聚焦完畢，膠柱兩端和玻管外壁用蒸餾水洗滌3次，以免沾有電極液而影響真實pH值。隨後從玻管中取出膠柱，-70℃冰凍lh，用切片機切成lmm厚的薄片。把兩個或兩個以上凝膠柱相同位置的薄片，按次序分別浸入0．5mlKCl0．0／mol／L溶液中，搖動幾分鐘，依次用微量電極測定其相應pH值。此外，也可將洗滌過的膠柱用刀片按0．5cm長度分段切下，按次序分別浸入4ml0．1mol／LKCl溶液中，在4℃環境下過夜。移至室溫平衡後，測出各段的pH值，以各段膠所在位置，即距離為橫坐標，以相對應浸泡液pH值為縱坐標作圖，便可繪出膠柱上的pH梯度曲線。
用適當方法把凝膠柱切成薄片，然後把各薄片分別放在含有一定量12．5％三氯乙酸溶液的5ml玻璃勻漿管中勻漿，離心後，凝膠塊分別用50X乙醇、無水乙醇和乙醚洗滌，用0．1mol／L甲酸溶液抽提3次，收集甲酸溶液凍乾，再溶解即可測定其蛋白質含量。
20世紀80年代初建立的固相pH值梯度電聚焦法(1PGIEF)是一種解析度很高的pI測定方法。其固相pH梯度凝膠是由一系列弱鹼性和弱酸性的丙烯醯胺衍生物與丙烯醯胺和雙丙烯醯胺在催化劑作用下形成的。用此衍生物製備固相pH梯度凝膠的過程是，將所需的該物質分別加入盛聚丙烯醯胺的混合瓶和儲存瓶中，經適當調節就能形成固相pH梯度凝膠。而它的pH梯度範圍則是由酸性和鹼性丙烯醯胺衍生物的比例和pK值等因素決定的。
根據膠柱上的染色位置(經校正後)，或洗脫液含有蛋白質的凝膠位置，與pH值的曲線圖相對比，即可測出蛋白質的等電點。
另外，用標準蛋白質的等電點(縱坐標)對其在電聚焦中移動的距離(橫坐標)作圖，即可得到標準的等電點曲線圖。當測定未知樣品的等電點時，只要在同樣的電聚焦條件下求出其移動的距離，就可以從等電點曲線中查出相應的等電點。
這種方法測定等電點的不足之處是，有些蛋白質能與兩性電解質載體發生可逆性結合，形成虛假的多重區帶，故用它鑑定蛋白質純度時必須注意。在電聚焦時，改變加樣品部位，或改變凝膠中兩性電解質的濃度，電泳圖譜不會發生改變。另外，電聚焦形成的單一區帶再進行電聚焦，其仍然為單一區帶時，則表明兩性電解質載體和待測樣品組分並不互相作用。經過這些檢測後，得出的等電點結果是可靠的。
