名稱
簡介
聚丙烯醯胺凝膠電泳 作用：用於分離蛋白質和寡核苷酸。作用原理聚丙烯醯胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯醯胺凝膠及SDS-聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯醯胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro於1967年建立，他們發現在樣品介質和丙烯醯胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑後，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。
補充信息
聚丙烯醯胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis）聚丙烯醯氨凝膠電泳，是以聚丙烯醯胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯醯胺凝膠由單體丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。化學聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，後者引發丙烯醯胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯醯胺與丙烯醯胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續系統和不連續系統兩大類，連續系統電泳體系中緩衝液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中由於緩衝液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及解析度均較前者佳。不連續體系由電極緩衝液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩衝液為pH6.7的Tris-HCl。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩衝液為pH8.9Tris-HCl。電極緩衝液是pH8.3Tris-甘氨酸緩衝液。2種孔徑的凝膠、2種緩衝體系、3種pH值使不連續體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩衝液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。
作用
SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去摺疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS後，分子被解聚成多肽鏈，解聚後的胺基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。SDS-PAGE一般採用的是不連續緩衝系統，與連續緩衝系統相比，能夠有較高的解析度。
濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩衝液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始後，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在後面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。
此鑑定方法中，蛋白質的遷移率主要取決於它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。
相關資料
聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）一、目的要求
（1）學習電泳原理和技術（2）學習和掌握SDS－聚丙烯醯胺凝膠圓盤電泳分離蛋白質技術
二、實驗原理
聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺（簡稱Acr）單體和少量交聯劑甲叉雙丙烯醯胺（簡稱Bis）通過化學催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合後的聚丙烯醯胺凝膠形成網狀結構。具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應。血清蛋白在聚丙烯醯胺凝膠電泳一般可分成12～25個組分。因此適用於不同相對分子質量物質的分離，且分離效果好。聚丙烯醯胺凝膠作為電泳材料的特性
人工合成聚丙烯醯胺凝膠的化學體系的組成及功能：
Acr：丙烯醯胺
Bis：甲叉雙丙烯醯胺
AP：過硫酸銨——化學催化劑
TEMED：四甲基乙二胺——加速劑
SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負電荷。在含有強還原劑的SDS溶液中可形成SDS-蛋白質複合物。由於結合大量帶負電荷的SDS，好比蛋白質穿上帶負電的“外衣”，蛋白質本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質分子之間自身的電荷差異的作用。
三、實驗材料
（一）試劑1、30%丙烯醯胺混合液（Acr:Bis 為29:1） 稱取丙烯醯胺（Acr）29g及甲叉丙烯醯胺（Bis）1.0g，用去離子水溶解並稀釋至100ml，貯棕色瓶中於4℃保存，可用一個月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩衝液取1mol/L HCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris）36.6g，加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調pH至8.8，然後用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩衝液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加雙蒸餾水至80ml，調pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。
4、Tris-甘氨酸電泳緩衝液 稱取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸餾水850ml，調pH至8.3，加蒸餾水到1000ml，4℃貯存。用時可做10倍稀釋。
5、10% 過硫酸銨（AP）（6）四甲基乙二胺（TEMED）或β-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。
6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉） 稱取SDS 10g，加蒸餾水100ml使其溶解。
7、四甲基乙二胺（TEMED）
8、上樣緩衝液取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩衝液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚藍10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。
9、考馬斯亮藍染色試劑考馬斯亮藍R250染色液：濃度為2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸餾水=5∶1∶5的溶液配製（V/V）。
10、脫色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml。
11、樣品：人血清。
12、蛋白質分子量標誌物市售中分子量蛋白質分子量標誌物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質自行配製，注意其分子量分布要能滿足需要，各種蛋白質的濃度基本相等。
（二）儀器圓盤電泳槽（或垂直板電泳槽）、穩壓穩流電泳儀、脫色搖床。
四、實驗方法
（一）準備圓盤電泳槽、電泳儀。（二）凝膠製備按下表分別配製分離膠和濃縮膠（此量可供2人用）
分離膠(12% 5ml) 濃縮膠(5% 2ml)
ddH2O 1.6ml 1.4ml
30%混合液 2.0ml 0.33ml
1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.3ml —
1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl — 0.25ml
10%SDS 50µl 20µl
10%Ap 50µl 20µl
TEMED 4µl 4µl
注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠後迅速用滴管灌膠
（三）灌膠
1、先將膠管（5х90mm）封好底，將配製好的分離膠液灌注入膠管內，約70mm高度（掌握分離膠的高度），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm）。用於隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。要在確認分離膠徹底凝固後才開始配製濃縮膠。
2、分離膠凝固好後，倒掉覆蓋在分離膠表面的正丁醇，並用去離子水沖洗一次，倒置吸淨殘留的水。將配製好的濃縮膠液灌注入膠管內（約15mm），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm），用於隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。膠凝固好後，倒掉覆蓋在膠表面的正丁醇，並用去離子水沖洗一次，倒置吸淨殘留的水，準備加樣。
（四）樣品預處理和加樣
1、取血清0.1ml、上樣緩衝液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。
2、將膠管封底去掉，放入圓盤電泳槽中，套緊，不能有空的孔，將Tris-甘氨酸電泳緩衝液加入圓盤電泳上、下槽中，電泳緩衝液要蓋過膠管口，然後用微量加樣器（或注射器）將樣品10μl加到膠管膠面內。
（五）電泳上槽接負極，下槽接正極，先調電壓為120v/濃縮膠，開始電泳，當指示染料進入分離膠後，將電壓增加到80v/分離膠膠，繼續電泳直至染料抵達距分離膠下端約1cm處，停止電泳，斷開電源。電泳時間約1.0~1.5h。
（六）考馬斯亮藍染色
電泳結束後，取出電泳膠管，用長注射器針剝膠，一邊注水一邊推膠，直至膠出。將膠移至大培養皿中，精確量取並記錄凝膠長度和指示染料的遷移距離（分離膠上緣到染料條帶中心距離），然後將凝膠板浸入考馬斯亮藍染色液中0.5-1h，再用脫色液脫色1~2天，至背景無色為止。區帶可作定性或定量分析。
（七）校正曲線的數據處理和分子量測定精確量取並記錄染色後凝膠長度、各標誌蛋白質和各待測蛋白質區帶的遷移距離（分離膠上緣到各蛋白質區帶中心）。按下式計算各蛋白質的相對遷移率（Rm值）。
Rm =
在半對數紙上，以各標誌蛋白質的Rm值為橫坐標（普通尺度），相應的分子量為縱坐標（對數尺刻度）作圖，即得分子量校正曲線。根據各待測蛋白質的Rm值，查此校正曲線，可求各待測蛋白質的相對分子量。
五、注意事項
1．制膠過程中用正丁醇封住膠面是為了阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。2．本法也適合於其他生物樣品中蛋白質的分析。上樣量不宜過大，否則會出現過載現象。尤其是考馬斯亮藍R250染色，在蛋白質濃度過高時，染料與蛋白質的氨基(－NH)形成的靜電鍵不穩定，其結合不符合Beer定律，使蛋白質量不準確。
3．Acr和Bis有神經毒性，可經皮膚、呼吸道等吸收，故操作時要注意保護。
附表1分子量範圍與凝膠濃度的關係
蛋白質 核酸(RNA)
分子量範圍 適用的凝膠濃度/(%) 分子量範圍 適用的凝膠濃度/(%)
<104 20-30 <104 15–20
1-4×104 15-20 104–105 5-10
1-5×104-1×105 10-15 105-2×106 2-2.6
1×105 5-10
>5×105 2-5
