簡介
本儀器分析的對象是一粒單晶體，如一粒砂糖或一粒鹽。在一粒單晶體中原子或原子團均是周期排列的。將X射線（如Cu的Kα輻射）射到一粒單晶體上會發生衍射，由對衍射線的分析可以解析出原子在晶體中的排列規律，也即解出晶體的結構【1】。物質或由其構成的材料的性能是與晶體的結構密切相關的，如金剛石和石墨都是由純的碳構成的，由於它們的晶體結構不同就有著截然不同的性質。
原理
（一）晶體衍射的基本公式
由於晶體中原子是周期排列的，其周期性可用點陣表示。而一個三維點陣可簡單地用一個由八個相鄰點構成的平行六面體（稱晶胞）在三維方向重複得到。一個晶胞形狀由它的三個邊（a,b,c）及它們間的夾角（γ，α，β）所規定，這六個參數稱點陣參數或晶胞參數,見圖1。這樣一個三維點陣也可以看成是許多相同的平麵點陣平行等距排列而成的，這樣一族平麵點陣稱為一個平麵點陣族，常用符號HKL（HKL為整數）來表示。一個三維空間點陣劃分為平麵點陣族的方式是很多的，其平麵點陣的構造和面間距d可以是不同的，見圖1。晶體結構的周期性就可以由這一組dHKL來表示。
圖1 代表結晶體周期性的點陣
一個小晶體衍射X射線，其衍射方向是與晶體的周期性（d）有關的。一個衍射總可找到一個晶面族HKL，使它與入射線在此面族上符合反射關係，就以此面族的符號HKL作為此衍射之指數。其間關係用布拉格方程（式1）來表示。
2dHKLsinθHKL=nλ （1）
式中,θHKL為入射線或反射線與晶面族之間的夾角(見圖2)，λ為入射X射線波長，n為反射級數。
圖2 布拉格反射示意圖
衍射線的強度是與被重複排列的原子團的結構，也即和原子在晶胞中的分布裝況（坐標）有關，其間的關係由方程式（2）表示
式中, E稱為累積能量，I0為入射線強度，e, m為電子的電荷與質量，c為光速，λ為X射線波長，Vu為晶胞體積，稱洛侖茲偏振（LP）因子，|F|為結構振幅，e-2MT為溫度因子，A為吸收因子，V為小單晶體的體積，ω為樣品的轉速，其中結構因子
=|FHKL|eiαHKL （3）
式中, fj, xj,yj,zj 分別為第j個原子的原子散射因子及它在晶胞中的分數坐標（以晶胞邊長為1）。n為晶胞中的原子數。αHKL為HKL衍射的相角。從此式可知衍射線強度是與各原子在晶胞中的位置（即結構）有關的，故反過來可從衍射線強度的分析解出晶胞中各原子的位置，即晶體結構。其方法是 （4）
通過晶胞中的電子密度ρ（x,y,z）的計算。
故若知各衍射的FHKL, 就可按（4）式計算晶胞的三維電子密度圖。原子所在處電子密度應該很高，故依此可定出原子在晶胞中位置，得出晶體結構。但是從衍射強度獲得的是結構振幅|F|，|F|與F之間的關係見式（3）。如何求得各HKL衍射的相角αHKL就成為X射線單晶衍射解晶體結構的關鍵。
（二）對實驗的要求和實驗儀器
1．對實驗的基本要求：
要按式（4）來求解晶體結構，就要有儘可能多的衍射的FHKL，而且其值要準確, 這樣所得的ρ(x,y,z)分辯率就高，求得的結構就準確。一粒小晶體衍射的X射線是射向整個空間的。具有大的HKL，也即大θ或小d值的衍射的強度一般比較低，不易測得。如何在三維空間測得儘可能多的，儘可能準確的衍射線強度成為對X射線單晶體衍射儀的基本要求。
2．實驗儀器
若將一束單色X射線射到一粒靜止的單晶體上，入射線與晶粒內的各晶面族都有一定的交角θ，其中只有很少數的晶面能符合布拉格公式而發生衍射。如何才能使各晶面族都發生衍射呢？最常用的方法就是轉動晶體。轉動中各晶面族時刻改變著與入射線的交角，會在某個時候符合布拉格方程而產生衍射。目前常用的收集單晶體衍射數據的方法,一為回擺法，二為四圓衍射儀法。
（１）回擺法：
回擺法的裝置如圖3，樣品的轉軸垂直於入射單色X射線，圍繞轉軸安裝園筒狀底片或在晶體後方，垂直於入射線安裝平板底片。若晶體的某一晶軸（如a或b, c）與轉軸平行，則在園筒狀底片上會出現平行直線，平板底片則出現上下對稱的雙曲線。若讓晶體在一個不大的角度範圍（如10）內做擺動，則能產生的衍射數量不多，衍射點不會重疊。使擺動範圍連續變動，一套完整的衍射數據需由一套（如幾十張）擺動照片組成，其數量與晶體的對稱性有關。
圖3回擺法裝置構造示意圖。
回擺法是一種早就發明的衍射方法，它的記錄介質過去用的是照相底片，很不方便，因此用得不多。二十世紀九十年代發展出一種稱為影象板（image-plate IP）的記錄介質，由於其靈敏度高，記錄的強度準確，且使用方便，實驗時間短，獲得了推廣，套用到回擺法，使回擺法獲得新生, 成為測定單晶體結構的主要方法。以後又出現了新型探測器電荷偶合器件（charge-couple device CCD），其性能在一些方面更優於IP，有成為主要探測器的趨勢。
（２） 四圓衍射儀法
儀器構造示意於圖4。常用閃爍計數器作探測器。入射光和探測器在一個平面內（稱赤道平面）, 晶體位於入射光與探測器的軸線的交點，探測器可在此平面內繞交點鏇轉，因此只有那些法線在此平面內的晶面族才可能通過樣品和探測器的鏇轉在適當位置發生衍射並被記錄。如何讓那些法線不在赤道平面內的面族也會發生衍射並能被記錄呢？辦法是讓晶體作三維鏇轉，有可能將那些不在赤道平面內的晶面族法線轉到赤道平面內，讓其發生衍射，四圓衍射儀正是按此要求設計的。圖4(a),(b)為按上述原理設計的，構造上略有不同的兩種四圓衍射儀。此法曾經是二十世紀八，九十年代的主要實驗方法。此衍射儀的特點是用閃爍計數器逐點記錄各衍射，因此比較費時，常常需要幾天甚至超過一個星期的時間。以後，他不能適應生物大分子要求快速記錄衍射數據的要求，IP、 CCD的出現，快捷的回擺法就逐漸取代他成為測定生物大分子結構的主要工具。四圓衍射儀法在小分子結構的測定中還有一定套用。
圖4．四圓衍射儀的構成示意圖
二．衍射數據的處理——晶體結構的解析
（一）一般步驟
1． 選擇大小適度，晶質良好的單晶體作試樣, 收集衍射數據。
2． 指標化衍射圖，求出晶胞常數，依據全部衍射線的衍射指標，總結出消光規律，推斷晶體所屬的空間群。
3． 將測得的衍射強度作吸收校正，LP校正等各種處理以得出結構振幅|F|。
4． 相角和初結構的推測。常用推測相角的方法有派特遜函式法及直接法。
派特遜函式的定義為：
從派特遜圖上可以比較容易地得到晶體中所含重原子的位置坐標，可依此計算各衍射的相角
αHKL，將此αHKL去與實驗測得的結構振幅|FHKL|結合生成FHKL，可據此計算電子密度圖，可以定出更多原子的原子位置及修正已有的原子位置。再利用這些數據重新計算αHKL、FHKL及ρ（x,y,z），如此反覆疊代多次推出完整的晶體結構。
直接法是利用結構振幅間的某些統計關係求出衍射相角的方法。在求出某些衍射的相角αHKL以後，把他們去與實驗測得的|FHKL|配合生成FHKL，進而計算ρ（x,y,z），從中獲得部分原子的位置，從此修正和擴充已有的相角，如派特遜那樣反覆疊代以得出完整的結構。
5．結構的精修。由派特遜函式或直接法推出的結構是較粗糙和可能不完整的，故需要對此初始結構進行完善和精修。常用的完善結構的方法稱為差值電子密度圖，常用的精修結構參數的方法是最小二乘方法，經過多次反覆，最後可得精確的結構。同時需計算各原子的各向同性或各向異性溫度因子及位置占有率等因子。
最終所得結果的優劣常用吻合因子R來衡量
式中，w為權重因子，下標o，c表示實測值，計算值。
6． 結構的表達：在獲得精確的原子位置以後，要把結構完美的表達出來，這包括鍵長鍵角的計算，繪出分子結構圖和晶胞圖，並從其結構特點探討某些可能的性能。
（二）生物大分子結構的測定【4】
生物大分子結構的測定，從原理上講與小分子（無機物，有機物，配合物等）無異，但由於分子大也帶來一定的特殊性，需要有一些不同於小分子的方法。
大分子的特點是分子量大，原子多，但原子序數小, 多數是C，H，O，N等輕元素，故散射能力低，不易收集到高角的衍射點，這會使電子密度圖的解析度降低。還因他晶胞大，所含原子數目多，需確定的結構參數就多，這與解析度低有矛盾。另外，大分子晶體在X射線的照射下易於損壞，如何縮短實驗時間也成為一個重要問題。
大分子由於分子量大，要求使用較大體積的單晶體，如對於分子量為5000的蛋白質分子，就要有大於0.3mm3的單晶體。但因其分子大，結晶就困難，而且很易結晶成孿晶，這不合用。得到合用的晶體是整個大分子結構測定中關鍵的一步，常說有了良好的晶體，結構測定一半的問題已解決了。
一般用回擺法收集衍射數據，用IP或CCD作探測器，可以在幾個小時內完成數據收集工作。
關於相角問題，在解小分子結構中目前最常使用的直接法還不能用於大分子，而派特遜法，由於大分子缺少重原子也無法使用。目前是用基於派特遜法的幾個方法來解決相角問題的。
（1）分子取代法：
有時, 幾個不同的生物大分子是由相同的結構單位以不同方式連線而成的; 同一種生物大分子如在不同的條件中結晶,有可能得到不同的結晶,是為多結晶現象; 還有些生物分子,他們是由共同的分子祖先進化而得, 因此其中有相當部分是相同的。 對於這些類的生物分子,他們的派特遜圖常有很大的相似性。 因此，在求解某生物大分子結構時,如能找到與他有類似的結構,且結構已測定的生物大分子結構時,則可按最大重疊原理找出待測物和已知物的派特遜圖之間的關係, 從而得出未知物衍射的位相,進而解出結構。若已知物和待測物是同晶化合物,則可利用差值電子密度圖來解出結構,更為簡單。
若在已知結構的大分子結構資料庫中找不到與待測物有類似結構的分子結構時,就不能使用此法,要使用以後的方法。
（2）重原子同晶置換法：
這種方法是設法把對X射線散射能力大的重金屬原子，如Hg，Pb，Se等引入生物分子中，作為標識原子。這種置換入重原子的大分子應與無重原子時的原晶體有相同的晶胞參數和空間群，且絕大多數原子的位置相同，故稱同晶置換。從這些含重原子晶體的衍射數據，利用基於派特遜法的方法可解出重原子的位置，據此算出其結構因子和相角，進而利用相角關係計算出沒有重原子的原晶體的相角，解出結構。
經常使用不只一種重原子進行置換，以得幾種同晶置換衍生物, 稱多對同晶置換法。同晶置換
衍生物越多, 可正確定出的相角也越多。
（3）反常散射法
晶體衍射中有一條弗里德耳定律, 就是說不論晶體中是否存在對稱中心,在晶體衍射中總存在著對稱中心,也即有FHKL=FHKL。但是當使用的X射線波長與待測樣品中某一元素的吸收邊靠近時,就不遵從上述定律,也即FHKL≠FHKL。這是由電子的反常散射造成的, 利用這一現象可以解決待測物的相角問題。 一般, 這一方法常與重原子同晶置換法結合使用。
在收得同晶置換物的衍射數據後, 改變入射線波長至靠近重原子的吸收邊處，再次收集數據，這套數據是存在反常散射的,可利用這兩套數據來求位相。有如多同晶置換法,如採用幾個不同波長的X射線,對所含不同元素收集幾套反常散射數據,則可得更正確、更完整的相位信息,是為多波長反常衍射法(MAD),是目前解分子生物大分子的重要方法。實驗室X射線光源不易使用這一方法, 因要改變X射線波長是很困難的,而對於同步X射線光源, 改變波長是相當方便的, 因此常被使用。
套用
晶體結構的測定對學科的發展、物體性能的解釋、新產品的生產和研究等方面都有很大的作用,其套用面很寬,不能盡述,略談幾點如下:
(一)．晶體結構的成功測定,在晶體學學科的發展上起了決定的作用。因為他將晶體具有周期性結構這一推測得到了證實,使晶體的許多特性得到了解釋:如晶體能自髮長成多面體外形(自范性),如立方體的食鹽、六角形的水晶等,又如晶體各種物理性質(光性,導熱性等)的各向異性和對稱性等等。晶體學的發展有了堅實的基礎。
（二）．礦物學中曾有不少礦物的元素構成很接近,但他們的性質相差很遠(如石墨和金剛石都是碳,還如一些矽酸鹽),而有的礦物其物理或化學性質相近,但其元素組成又很不相同(如雲母類礦物等)，使人困惑。晶體結構的測定使性能的異同從結構上得到了合理的解釋。如石墨因是層狀結構，層間結合力差，故較軟，而金剛石為共價鍵形成的骨架結構，故結合力強，無薄弱環節, 成為最硬的材料。
（三）．人類和疾病作鬥爭,總離不開藥物。原始的藥物是天然產物,動植物或礦物。以後隨著科學的發展,開展了從天然產物中提取有效成分的方法,而有效成分晶體結構的測定進一步將從天然產物中提取的方法改變為人工合成，使有可能大量製造，提高了產量、降低了成本、造福於人類。這種基於結構,設計出合成路線，工業製造的方法在染料，香料等許多工業部門都是廣泛使用的。
（四）近年，基於病毒結構、人體內各種大分子結構的測定及人體感染疾病途徑的了解，搞清了某些疾病感染及發展的結構匹配需要。人類已經根據這些結構知識設計結構上匹配的、合適的藥物，來事先保護病毒和人體的結合點，或阻斷病毒的自身繁衍，從而避免感染或控制其繁衍，而不使疾病發展, 這就是所謂的基於結構的、合理的藥物設計【6】。圖5中為愛滋病毒複製過程中不可缺的蛋白酶及人類設計的對稱性抑制劑A-74704（方框內）之間的氫鍵結合模式。由於抑制劑的結合阻斷了病毒的結合，使其無法複製。改變了過去神農嘗百草型的經驗尋找藥物的方法。
圖5 抑制劑與蛋白酶的氫鍵結合
可能的發展方向：
（一）數據的積累
從前述的套用已經看出，晶體結構的測定及結構與性能關係的研究, 是今後走上人類按需設計新材料的基礎。今日雖已測了許多晶體的結構,但還有許多未能測定,而且還不斷有新化合物，新晶體出現, 因此不斷的測定他們的結構,加以總結分析是十分必要的。當今已有多個晶體結構資料庫，如：（1）劍橋結構資料庫（CSD）。包括各種有機，有機金屬化合物及配合物的晶體學數據。（2）無機晶體結構資料庫（ICSD）。（3）金屬結晶學資料庫（CRXSTMET）。(4）蛋白質資料庫（PDB）。（5）晶體學數據（CD）。（6）粉末衍射卡片（PDF）。(7）有序無序結構資料庫（OD）等。
（二）各種生物大分子結構的測定
2001年2月12日，人類基因組框架圖發表。接下來的任務是要把各基因的結構和功能搞清楚，有大量的基因結構需要測定。世界上已經成立了結構基因組的國際合作組織，分配人類基因結構的測定任務。除了人類基因以外，還有水稻基因組，各種病毒等範圍更廣的生物大分子結構需測定。生物大分子的數量將會遠遠超過各種無機物，有機物分子的總量。生物大分子結構測定將是今後晶體結構測定的主要任務。
（三）結構與性能關係的研究與套用
按照已知的結構和性能的關係設計製造需要的新材料是進行大量結構測定的目的。如何總結大量已測結構的規律並與其性能、功能相聯繫是今後的任務之一。特別是生物結構與功能的關係。進一步如何利用這種關係設計製造人類需要的材料，藥物等, 更是永不完結的任務。
（四）解生物大分子結構方法的發展
目前雖已有各種方法用來解決相角的問題，但要置換許多同晶化合物還是頗費時和頗昂貴的，如果能如小分子那樣用直接法來解決相角問題，將會方便許多。我國科學家范海福院士是研究直接法的世界權威人物，正在進行這方面的研究。
(五) 單晶體結構分析實驗方法的發展
目前的實驗室單晶體結構分析方法對於測定小分子的單晶體結構已經是相當完美了, 但對於巨大的生物大分子就顯得軟弱無力，主要是光源強度不夠，光的平行性不良，波長又不好調。目前主要要依靠同步輻射作為X射線源。我國二個同步輻射光源之一的位於合肥的國家同步輻射實驗室（NSRL）今年上半年已勝利完成用於生物大分子結構測定的光束線與實驗站的建設, 並已收集到尖吻蝮蛇蛇毒磷脂酸A2，神經毒等多種生物大分子的衍射數據，並解出了結構。另一個北京同步輻射裝置(BSRF) 的生物平台使用的是聚焦光束。也已於2002年12月4日投入試運轉，在樣品冷凍條件下成功地收集了18套結構數據，情況良好。數據分析正在進行中。
同步輻射是一種大科學裝置，設備大投資高，一般都需要政府投資，不是一般實驗室所能具備的，需要申請立項才能使用。因此，如果能發展出高強度的實驗室光源和極高靈敏度的探測器，使在一般實驗室中也能測定生物大分子結構，則絕對是有益的。
有許多生物反應的速度是相當快的, 如血紅蛋白與一氧化碳的結合，速度在納秒級（10-9sec），要對這種反應進行動力學研究，既要有高強度脈衝光源, 又要有快速切換的探測器以連續跟蹤反應。現在已有了強脈衝光源，但探測器的切換速度卻慢太多，需要作長時間的更大的努力。
