Tilling 技術簡介
TILLING，即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向誘導基因組局部突變技術），是由美國Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikoff領導的研究小組發展起來的，是一種全新的反向遺傳學研究方法。TILLING技術藉助高通量的檢測手段，快速有效地從由化學誘變劑(EMS)誘變過的突變群體中鑑定出點突變。目前，TILLING已被套用於多種生物的研究中。
Tilling技術主要流程
以植物為例，Tilling技術主要流程如下：
1：甲基磺酸乙酯（ EMS）誘變種子，誘導產生一系列點突變；
2：將種子培養，獲得第一代突變個體 (M1)；
3： M1植株自交，產生第二代植株 (M2)；
4：按單株抽提 M2植株的 DNA，存放於 96孔微量滴定板，並保留 M2代種子；
5：將多個 96孔板的 DNA樣本合併到一個 96孔板內 (最多可合併 8個，每塊板相當於 768個 M2單株 )構建 DNA池；
6：根據目標基因序列設計一對特異性引物進行 PCR擴增，兩個引物分別用 700nm和 800nm螢光染料標記；
7： PCR擴增片段變性、退火，從而得到野生型和突變型所形成的異源雙鏈核酸分子；
8：用特異性識別並切割錯配鹼基的核酸內切酶 CELI酶剪下異源雙鏈核酸分子；
9：酶切產物用變性的聚丙烯酞胺 (DPAGE)凝膠電泳分離，然後用標準的圖象處理程式分析電泳圖象，獲得突變池；
l0：利用相同方法從突變池中篩選突變個體；
ll：突變個體 PCR片段測序驗證；
l2：突變表型鑑定。
Tilling技術的特點
A 、技術相對簡單
由於 TILLING技術是傳統的化學誘變技術與雙色紅外螢光檢測技術的有機相結合，不需要複雜的技術和設備就可以對突變體庫進行大規模篩選，是一種高通量並且相對廉價的技術，提高了篩選效率。
B 、可以預測突變頻率，獲得滿意的突變密度使用群體較小
TILLING 技術可以預先估計突變的機率，指導突變體庫的構建。化學誘變技術的突變頻率可以預先估算出來，如 EMS主要誘導鹼基從 C到 T的改變，有實驗證實，發生 C/G到 T/A的轉變有 99%的機率。對這一頻率的計算對於確定目標基因的最佳擴增片段有重要的指導意義。於不同物種、不同受體的誘變頻率有很大差異，對突變頻率的合理估算將增加 TILLING的效率。據現有的擬南芥 ATP項目的粗略計算，每 1Mb約含有 4個突變，即每 250kb左右含有 1個突變，以這一突變密度估算，獲得滿意的突變密度所需的突變體群體大小小於 10000個植株。
C 、高通量、自動化操作可以快速獲得鑑定結果
TILLING 技術集成了自動加樣設備、高通量的電泳檢測設備，以及優秀的圖象處理和分析系統，容易的實現了自動化操作。目前擬南芥中 TILLING技術己能夠完全自動化。對於有著高突變頻率的群體 (如 ATP項目中，每個基因組中含有約 1000個突變，即突變頻率約為每 1Mb含有 7個突變 )，一天就可以篩選出 20個突變，至少可以獲得一個被敲除的基因突變和超過 12個以上的一系列錯義突變。如果用標準的自動加樣器結合自動化手臂的操作替代手工操作，有望把篩選量增加到每天 16輪，這樣每天就可以鑑定 3到 4個基因。由此可見， TILLING技術適應了大規模高通量的篩選要求。
