轉基因生物商業化現狀
自首例轉基因番茄‘FLAVR SAVR’於1994年在美國批准商業化以來, 全球轉基因作物種植面積持續增長, 據ISAAA公布的數據, 截止2012年底全球轉基因作物種植總面積已達到1.7億公頃, 較1996年增長了94倍多。種植面積排名前十的國家都超過了百萬公頃, 其中美國為69.5百萬公頃, 占40.8%; 其次是巴西, 占21.5%; 阿根廷占14.03%; 加拿大占6.8%; 印度占6.3%; 我國為400萬公頃, 占2.4%, 位居第六。2012年總計59個國家和地區生產和套用轉基因作物, 涉及25種作物、319個轉基因事件。預計在未來的若干年裡, 轉基因的種植面積和商業化進程會持續增長, 並會對社會可持續發展產生深遠影響。
轉基因生物及其產品主要檢測技術
從分子生物學水平來看, 轉基因檢測是針對其轉入的外源基因後的特異性DNA序列和其表達的蛋白質展開的。因此, 轉基因檢測方法可以分為基於蛋白質水平的檢測方法和基於核酸水平的檢測方法兩大類。
基於蛋白質水平的檢測技術
蛋白質檢測技術都是基於免疫學的原理, 即轉基因生物表達的特定蛋白可作為抗原和抗體特異性結合，是一種直觀、快速的檢測方法。目前, 酶聯免疫吸附法和側向流動免疫測定是兩種最主要的基於蛋白的轉基因產品檢測方法。酶聯免疫吸附法是一種將免疫反應和酶的高效催化反應結合的檢測方法。外源目的蛋白與抗體結合後, 再結合酶標抗體, 加入底物後通過酶促反應形成有色物質, 就可根據顏色變化判斷是否為轉基因外源蛋白，並計算其含量。近年來, 研究者已經建立了不同轉基因生物的ELISA檢測方法, Kim等(2010)建立了一種ELISA方法檢測韓國轉基因辣椒Subicho不同組織中bar基因編碼的乙醯轉移酶和npt II基因編碼的新黴素磷酸轉移酶；Tan等(2013)發明了一種三明治式ELISA方法(sandwich ELISA), 可以檢測轉基因棉花中的胰蛋白酶抑制因子CpTI。此外, 全球各大公司也開發了各種商業化的ELISA轉基因生物檢測試劑盒檢測不同外源基因表達的蛋白，其檢測極限最高可達0.1%。側向流動型免疫試紙同樣基於抗原抗體特異性結合的原理, 以硝化纖維為固相載體, 在抗體上聯結顯色劑並固定在試紙條內, 將試紙條一端放入含有外源蛋白的組織提取液中, 通過毛細管作用使提取液向上流動, 抗體與外源蛋白結合則會呈現顏色反應, 一般5~10 min可以獲得檢測結果。Liu等(2013)發明了一種膠體金免疫試紙條, 可成功檢測轉基因牛牛乳中的人乳鐵蛋白。目前很多轉基因檢測側向流動型免疫測定試紙條已經商業化套用。
基於核酸水平的檢測技術與策略
由於核酸分子, 特別是DNA分子的穩定性強, 基於核酸的檢測方法已成為轉基因生物檢測的主要手段(張建中等2011), 主要的核酸檢測技術包括定性PCR和實時螢光定量PCR。近年來, 已有大量文章報導了不同轉基因生物品種的定性PCR和定量PCR檢測方法(表4)。但無論使用定性還是定量PCR技術, 轉基因產品檢測都基本按照以下流程進行。(1)檢測是否含轉基因成分: 通過篩選PCR確定樣品中是否含轉基因作物的通用元件、標記基因等; (2)具體含有什麼轉基因作物品系: 通過構建特異性和品系特異性檢測方法來鑑定轉基因成分具體源於哪種特定的轉基因品系; (3)轉基因成分含量: 運用定量PCR的方法來測定樣品中轉基因成分的具體含量 。
核酸檢測新技術
隨著轉基因數量急劇增加, 開發多靶標、高通量的PCR檢測方法日益重要, 各種新型複合PCR方法應運而生, 包括複合PCR、兼併複合PCR和微滴複合PCR等。複合PCR是指在一個反應體系中, 同時加入多對引物, 擴增不同的特異性片段, 最後通過凝膠電泳分離這些片段。Lu等(2010)成功建立了能同時檢測6種常見轉基因元件多重PCR, 分別針對35S啟動子、NOS啟動子和終止子、nptII (neomycin phosphotransferase, 新黴素磷酸轉移酶基因)、CP4epsps (5-enol form pyruvic acid-shikimic acid-3-phosphate synthase, 5-烯醇式丙酮醯-莽草酸-3-磷酸合酶)基因和pat (phosphinothricin Nacetyltransferase, 草丁膦轉移酶)基因。兼併複合PCR (degenerate MPCR)是通過設計兼併PCR引物來檢測一種針對同一性狀基因或一類性狀基因的同源核苷酸序列的新型複合PCR。Guo等(2012)建立了一種四重兼併引物PCR方法, 同時擴增轉基因作物主要使用的8個外源目的基因, 理論上可覆蓋90餘種轉基因作物。微滴PCR(microdroplet PCR)技術可將單個DNA分子被分配到納升級(0.5 fL~0.5 nL)的微滴中進行擴增, 1uL乳化劑中能形成約107個反應, 可極大提高擴增通量, 減低複合PCR中多對引物和多模板間的干擾。Guo等(2011)發明了一種微滴聚合酶鏈式反應-毛細管凝膠電泳分析系統(MPIC), 同時檢測了9個轉基因品種的24個靶標, 檢測靈敏度可達39個拷貝。DNA晶片技術日趨成熟, 使用DNA晶片進行轉基因生物的高通量檢測已得到商業化套用。如Nesvold等(2005)設計了一種基因晶片用於檢測單個未知轉基因生物。新發展的Tilling晶片含有高密度的覆瓦式的寡核苷酸探針, 能夠高密度、高通量地從全基因組水平上對轉基因生物進行分析,已經用於未知或者非法轉基因生物的檢測。二代測序技術(next-generation sequencing, NGS)即高通量測序, 一次實驗可以讀取1 G到14 G鹼基數。現有的技術平台主要有454焦磷酸測序、Solexa測序、SOLiD測序、Polonator測序和HeliScope測序技術等(Mardis 2008)。二代測序技術是在傳統測序技術上飛躍性的進步, 在轉基因檢測中將具有廣闊的套用前景, 如Teng等(2009)通過454焦磷酸測序, 並基於計算機減法算法建立了一種未知轉基因擬南芥的檢測方法, 為未知轉基因生物的檢測提供了一種可能。等溫擴增技術是近年發展起來的快速核酸檢測技術, 擴增過程不需要溫度循環, 較PCR技術有快速、低成本、靈敏等優點。核酸等溫擴增技術有很多種, 其中環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)已較多的套用在轉基因檢測中。LAMP技術通過設計能識別靶標序列6個區域的2對引物, 在Bst聚合酶作用下, 經過恆溫(60~65 ℃)約40 min即可完成核酸擴增(Notomi等2000)。Lee等(2009)通過LAMP方法檢測到了轉基因油菜和大豆中的35S啟動子和NOS終止子, 靈敏度可達0.01%轉基因含量; Chen等(2011)則發明了一種可視化的LAMP技術, 可通過肉眼直接判斷樣品中是否含有轉基因產品; Kiddle等(2012)則通過將一種螢光報告基團BART與LAMP技術聯用, 可以檢測到0.1%轉基因含量, 提高了LAMP檢測的靈敏度。數字PCR (digital PCR)是近幾年新發展起的一種核酸精確定量技術, 該技術是通過將微量樣品大倍數稀釋和細分, 直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個後, 再將所有細分試樣同時在相同條件下進行PCR擴增, 之後對細分試樣逐個進行計數, 從而判斷樣品的起始數量。數字PCR是一種絕對測量方法, 無需建立標準曲線, 並且檢測的靈敏度高達1.85拷貝·微升-1(Leonardo等2011)。目前, 數字PCR主要有三類平台, 分別是基於集成流體通路(IFC)晶片技術的數字PCR (chamber 數字PCR)、微滴式數字PCR和基於親疏水晶片和通道技術的數字PCR。數字PCR已經套用於轉基因生物檢測, 特別是轉基因標準物質的量值測定。如Corbisier等(2010)使用數字PCR技術對轉基因玉米MON810製備的歐盟標準物質的內、外源基因進行了絕對定量分析, 其結果和歐盟的定值結果一致; Burns等(2010)分析了數字PCR在轉基因檢測中的套用, 認為該技術非常適用於極低拷貝轉基因樣品定量和標準物質的定值 。
