技術的建立
大多數生物體進化都來自於自然選擇和性繁殖,其中在真核生物性重組便是生物進化的一種主要方式。早在1990年, Marton和Meyerhans等人就已經發現在體外PCR中存在的DNA重組現象,並指出該重組現象是由DN A斷裂或出現切口引起的。1994年美國的Stemmer 等以LacZα基因為實驗材料,用DNase I進行消化,得到10～ 70 bp大小的隨機片段集合, 在不加入引物的情況下, 利用PCR得到了全長的LacZα產物,從而以巧妙的設計驗證了體外PCR中存在的DNA重組現象。Stemmer 將該技術稱為體外DN A shuffling 技術,並於1998年申請了專利。由於該方法一定程度上模擬了生物體自然進化過程中減數分裂期等位基因間的DNA片段互換(有性交換, sexual exchange) ,故DNA shuffling 又被稱為有性PCR(sexual PCR) 。
技術的原理
DNA shuffling 技術是一種利用多次、反覆選擇和重組以獲得具有預期性狀的多聚核苷酸的方法。其原理大致如下: 先將由多種同源核苷酸序列組成的模板(初級文庫)進行隨機片斷化,所產生的隨機片段集合包含了至少1000種以上寡核苷酸,這些寡核苷酸來自不同的同源序列,具有不同的3′末端,這一點是下一步隨機重排的前提條件。利用PCR技術在不加入引物的情況下對這些隨機化片段進行重新排布: 在起初的幾輪循環中, 具有互補3′末端的來自不同模板序列的寡核苷酸互為引物,擴增出一段較長的核苷酸產物; 接著下一輪循環時,以上輪產物為模板,又將產生一段更長的核苷酸產物,隨著擴增數遞增,模板的不斷變化,產物長度亦在不斷遞增,如此,經過多輪擴增,最終將獲得多種低拷貝的全長的重排產物,這些集合的重排產物又被稱為嵌合文庫(突變文庫)。對嵌合文庫進行篩選,選擇改良的突變體組成下一輪shuffling 的模板(次級文庫) ,重複上述步驟進行多次重排和篩選,直到最終獲得性狀比較理想的突變體。
利用隨機化片段的重新排列組合產生多樣化的突變文庫是DNA shuf fling 技術的精髓所在,這一點有點類似assembly PCR。其優點是: 可以在體外實現同源序列間的重組,並可能實現那些對進化有利的點突變的最佳化組合,最終獲得性狀改良比較理想的突變體 。
具體方法
目的性狀的確立和模板的來源
目的蛋白的改造必須針對一定的表型特徵,即要針對特定的目的性狀,包括結構和功能方面的特性。如螢光蛋白的螢光強度、最大波長及酶的催化能力、熱穩定性、底物的專一性等。此外,一些DNA調控序列,如啟動子、5′UTR、3′UTR等也可以作為靶序列進行改造以改善其調控功能。模板可以由多個同源序列或同源基因(如家族基因)組成初級文庫( primary libiary ) ,也可以單個基因組成。後者在DNA shuffling 之前要先利用其它突變方法對單個基因進行突變, 或在DNA shuffling 的同時藉助聚合酶產生的點突變以產生多樣性的突變產物。同源靶序列的長度在50 bp～ 50 kb之間,一般通過PCR獲得,反應後應除去多餘的引物, 以提高重組效率。
隨機片斷化處理
初級文庫(模板)用DNase I或多種內切酶處理後,獲得隨機片段集合。隨機片段大小應在20～ 500bp之間為宜。並對片段集合進行純化,除去未消化的模板,以避免原序列的污染。
無引物的PCR擴增
在不加引物的情況下,將以上片段集合置於適當的PCR系統中進行PCR擴增。該步要求片段集合有較高的總量和濃度,同時還要求PCR反應有較高的循環數,以保證產生多樣性足夠好的嵌合文庫(突變文庫)。
加入引物的PCR擴增
上一步的PCR產物按一定比例稀釋,同時加入兩外側引物, 選用較少的循環數, 如15輪, 進行PCR擴增,便可獲得大量的全長目的基因,即放大的嵌合文庫(突變文庫)。有時PCR產物中還可能存在全長目的基因的線形多拷貝聚合體,如Stemmer等對全長2. 7 kb的pUC19質粒進行DN A shuffling 時,得到的產物大多在20 kb以上,但用適當的內切酶消化後,即得到均一的全長目的基因。
克隆、篩選、分析及多輪篩選
PCR產物用適當的內切酶處理,克隆到表達載體中並轉入宿主細胞(如大腸桿菌,噬菌體等)中進行表達,在特定的選擇壓力下,選擇目的性狀改良的突變體; 將選擇到的突變體混合在一起,作為下一次DNA shuffling 的模板(次級文庫) ,選擇壓力不斷提高,重複1～ 5步驟進行多次選擇和重組,直到最終得到性狀改良明顯的理想的突變體為止。在進行DNA shuf fling 時,最重要的是選擇合適的篩選模型,只有選擇的模型恰當,才會減少工作量,快速地實現預期目標。如欲提高酶的熱穩定性,應以不斷遞增的溫度為選擇壓力,通過突變產物(酶)對底物的活性變化來篩選熱穩定性改良的酶;如果改造對象是細菌的酶,還可以選擇該酶缺陷的細菌為宿主細胞進行篩選。
改進
自Stemmer提出DNA shuffling 以來, 這種體外DNA 重組的方式引起了各國學者濃厚的興趣, 包括Stemmer本人在內的許多學者提出各種改進方法, 使DNA shuffling 技術更加多樣化, 在不同需求的引導下發展出了一些各具特色的新方法 。
DNA-family -shuffling
DNA-family -shuffling 技術是根據自然界中存在許多物種來源不同、基因序列有所差異但功能相似的基因家族建立的, 用於改組的基因家族中的一組基因, 可以是來源於同一物種的某一基因家族, 也可以是來源於不同物種、屬間有一定程度同源性的基因, 該技術在體外模擬達爾文進化的過程, 大大提高了基因體外定向進化的速度和效率。
DNA-family -shuffling 技術與單基因shuffling 相比, 具有兩個明顯的優勢:首先, 改良效率高。Crameri A 等[2] 在實驗中選用了4 種同源性為58 ～ 82%的來自不同菌屬的頭孢菌素C酶基因作為親本, 改組後使酶活性增加了270 ～ 540 倍, 而單基因shuffling 只增加了8 倍。其次, 提高了突變機率。由於基因家族改組的塊交換特性(block -exchange nature), 使得突變的幾率大大提高了, 前例中β 內醯胺酶基因在3 次單基因改組循環後, 只得到了一株4 個突變胺基酸的突變株, 而四個頭孢菌素C 酶基因在一次DNA-family -shuffling 後就產生了102 ～196 個突變胺基酸的突變株。
StEP
StEP(Staggered extension process, 交錯延伸程式)是指在一個反應體系中以兩個以上相關的DNA 片段為模板, 進行類似PCR 反應, 合成在目的基因兩側的引物, 引物先在一個模板鏈上延伸, 隨之進行多輪變性和短暫的復性-延伸循環。每次循環被延伸的片段在復性時與不同的模板配對, 並延伸一段非常短的距離。由於模板的改變, 所合成的DNA 片段中包含了不同模板DNA 的信息。這種交錯延伸過程繼續進行, 直到獲得全長的基因。
StEP 在效果上與DNA shuffling 技術是類似的, 但與之相比省去了用DNA 酶切割成片段的過程, 因而更為簡便。StEP 技術的關鍵在於找到一個可以使引物退火(T退火>Tm -25 ℃)但又降低聚合酶反應速率或降低延伸溫度的反應條件, 使得片段可以隨機雜交到包含不同突變的模板上。
無PCR的shuffling
該方法利用一些限制性內切酶(如Fok 和Bbv 等), 其識別位點位於切割位點上游或者下游若干鹼基處, 對親本序列切割後生成的黏端通常是各不相同且非迴文序列的黏端, 酶切後用連線酶連線, 得到順序正確的重組裝基因文庫。該方法由王強等於2004 年提出, 他們構建了一個微型shuffling 文庫, 其親本分別為人組織型纖溶酶原激活劑(tissueplasminogen activator , tPA)基因以及含有7 個突變位點的tPA 基因。此方法操作相對簡便, 然而, 因為只有能產生彼此不同且非迴文序列黏端的內切酶可以使用, 此方法受到內切酶酶切位點特異性的限制, 使得DNA 片段化的隨機性較低, 還需要進一步完善。
SCRATCH
SCRATCH 技術是DNA shuffling 與ITCHY (Incremental truncationfor the creation of hybrid enzymes, 產生雜交酶的增加平截技術)相結合而產生的技術, 先將兩個相關酶基間經單酶切打開一個切口, 為外切酶Exo Ⅲ 提供作用位點, Exo Ⅲ 每隔一定時間(如30s)取一次樣、滅活。然後將兩基因的酶解產物混合,平端連線, 生成ITCHY 庫, 再以ITCHY 庫作為親本進行DNAshuffling 。
一般來說, DNA shuffling 不能用於改組同源性低於70% ～80%的基因, 而SCRATCH 具有不依賴基因序列的同源性而產生多個DNA 雜交位點的特點。
RACHITT
RACHITY(Random Chimeragenesis on Transient Templates , 過渡模板隨機嵌合技術)將某一親本基因作為臨時DNA 模板, 將另一親本基因(不同種或屬)進行酶切與臨時模板進行雜交,然後退火延伸連線成新鏈, 此時由於錯配或疊交將產生突變,形成突變基因庫。較目前報導的體外重組而言, RACHITT 是雜交次數最多的方法, 可以減少重排片斷的大小, 並增加每個基因的重組機率。
體外exon shuffling
體外exon shuffling是模擬自然界外顯子洗牌的過程, 在建立好的同源基因文庫中, 設計與各作為模板的同源基因的內含子有同源性的嵌合寡核苷酸, 以此作為引物進行擴增, 得到內含子-外顯子嵌合的片段, 此後再以擴增產物自身作為引物和模板進行PCR 反應, 獲得全長突變基因庫。該技術不局限於某單個基因的範疇, 而是將每個外顯子編碼的摺疊結構域作為單位, 因此, 體外exon shuffling 可以將多個不同功能的蛋白作為親本, 產生不同特性的突變基因庫,引入更多的理性設計。
套用
生物製藥
抗生素是生物醫藥的主要產品之一。但大量使用的結果導致病菌耐藥性的增強。1998年,Crameri等選用四個編碼頭胞黴素的基因進行DNAfamilyshuffling的改造提高的表達量比野生型的高34-68倍。Yano等在改造大腸桿菌對青黴素的抗性時也獲得了對其他抑制細胞壁形成的藥物的抗性。在疫苗和抗體;細胞因子;生長因子等方面也得到了套用。
工業
工業用酶常需表達量高,活性強,能耐酸鹼等極端環境。枯草菌素來自枯草桿菌是一種具有商業價值的絲氨酸水解酶。在改造後在對底物的活性、溫度敏感性、溶劑穩定性和pH值的依賴性都優於最佳親本。提高工業上的其他酶類如脂肪酶、蛋白酶、澱粉酶、植酸酶、漆酶、纖維素酶等在非生物環境下的穩定性,特異性。
育種
反轉錄病毒是人類基因治療的一種載體,但用常規培養工藝需將濃度提高100倍,因此常用超速離心等物理方法。但反轉錄病毒在這些方法中極不穩定,而喪失活性,這可能與病毒外殼蛋白組分有關。小鼠C型反轉錄病毒外殼蛋白由兩個亞基SU(gP70)和TM(PISE)組成,它們負責與細胞受體結合併與質膜融合。SU和TM是由不穩定的二硫鍵結合在一起的,反轉錄病毒的不穩定性是因為SU結構域的喪失。用DNAshuming的方法得到一批含複雜成分的重組外殼蛋白,並對超速離心具有抗性、穩定性高於親本30-100倍的新病毒系。同樣使用該方法得到了新的牛痘疫苗。
農業
Cigan等改造了從Pentadethra這種植物中獲得殺蟲基因獲得了新的pentin-l殺蟲基因,並申請了專利。Mepherson等則用DNA shuffiing等技術改善蛋白酶抑制劑的性質從而對廣泛的線蟲種群有很好的抗性。
環境工程
將一個可以把除草劑“勞去淨”脫氯的蛋白質經過多輪DNA shuffiing和篩選得到一個有n個胺基酸突變的新基因,用於城市污水處理系統。Kumamaru等在1998年和Fumkawa等在1995年通過改造降解PCB(多氯聯苯)的代謝途徑中的一些酶類來提高降解能力和範圍 。
