CTAB法

CTAB法

CTAB是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成複合物,但不會沉澱核酸。再通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質後,加入乙醇沉澱,即可使核酸分離出來。

全稱

CTAB法的全稱是十六烷基三甲基溴化銨法(cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide)。

用途

主要用於提取生物DNA

步驟

(1) 2%CTAB抽提緩衝液在65℃水浴中預熱。

(2)取少量實驗材料(約300mg)置於研缽中,用液氮磨至粉狀;

(3) 加入700ul的2%CTAB抽提緩衝液,輕輕攪動;

(4) 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌離心管中,磨碎液的高度約占管的三分之二;

(5)置於65℃的水浴槽或恆溫箱中,每隔10 min輕輕搖動,30~60min後取出;

(6)冷卻2 min後,加入氯仿-異戊醇(24:1)至滿管,劇烈振盪2~3 min(若提取的是總基因組,則不能劇烈震盪。),使兩者混合均勻;

(7)放入離心機中10 000 rpm離心10 min,與此同時,將600 ul的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中;

(8) 10 000 rpm離心1 min後,移液器輕輕地吸取上清夜,轉入含有異丙醇的離心管內,將離心管慢慢上下搖動30 sec,使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物;

(9)10000 rpm離心1 min後,立即倒掉液體,注意勿將白色DNA沉澱倒出,將離心管倒立於鋪開的紙巾上;

(10)60 sec後,直立離心管,加入720ul的75%乙醇及80 ul 5 M的醋酸鈉,輕輕轉動,用手指彈管尖,使沉澱與管底的DNA塊狀物浮游於液體中;

(11)放置30 min,使DNA塊狀物的不純物溶解;

(12)10000 rpm離心1 min後,倒掉液體,再加入800 ul 75%的乙醇,將DNA再洗 30 min;

(13)10000 rpm離心30 sec後,立即倒掉液體,將離心管倒立於鋪開的紙巾上;數分鐘後,直立離心管,乾燥DNA(自然風乾或用風筒吹乾);

(14)加入50 ul 0.5 × TE(含RNase)緩衝液,使DNA溶解,置於37℃恆溫箱約15 h,使RNA消解;

以上為通用CTAB法,實驗時可根據不同材料加以改進,以獲得最佳實驗結果.

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