利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成,每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP),並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團,使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整,使反應得到一組長几百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點,但終止在不同的的核苷酸上,可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段,凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。DNA的複製需要:DNA聚合酶,雙鏈DNA模板,帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物,4種dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指導,不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端,使引物延伸,合成出新的互補DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸,雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),因它在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基,故不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵。如,存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP(其中一種為α-32P標記)的情況下,將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫,即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段的混合物。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離製得的放射性自顯影區帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準確信息,從而將全部C的位置確定下來。類似的方法,在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下,可同時製得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結尾的三組長短不一的片段。將製得的四組混合物平行地點加在變性聚丙烯醯胺凝膠電泳板上進行電泳,每組製品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離,製得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的鹼基序列。與DNA複製不同的是sanger測序中的引物是單引物或者是單鏈。SangerDNA測序原理
相關詞條
-
雙脫氧鏈終止法
雙脫氧鏈終止法主要用於DNA基因分析,是現在套用最多的核酸測序技術(也即第一代DNA測序技術),由Sanger等1977年發明提出。
原理 測序程式 操作步驟 -
雙脫氧
用以確定核酸中核苷酸序列的一個方法。在分離出單鏈形式的核苷酸之後,使之與DNA雜合,然後與脫氧核苷酸和2′,3′-雙脫氧核苷酸的混合物一起在DNA聚合酶...
雙脫氧測序 簡介 Sanger法的試劑 測定戰略 測定方法 -
DNA測序
DNA測序(DNA sequencing,或譯DNA定序)是指分析特定DNA片段的鹼基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤的(...
測序目的 發展歷史 國內狀況 測序原理 測序規律 -
DNA測序技術
DNA測序技術,即測定DNA序列的技術。在分子生物學研究中,DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等(1...
介紹 材料 設備 試劑 操作 -
Sanger法測序
Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始,隨機在某一個特定的鹼基處終止,並且在每個鹼基後面進行螢光標記,產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系...
-
基因測序儀
基因測序儀又稱DNA測序儀,是測定DNA片段的鹼基順序、種類和定量的儀器。主要套用在人類基因組測序、人類遺傳病、傳染病和癌症的基因診斷、法醫的親子鑑定和...
原理 分類 臨床套用 發展歷史 擴展閱讀 -
鏈終止DNA測序法
鏈終止DNA測序法又稱Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法,是Sanger於1975年發明的,目前最普遍最先進的方法,是將雙脫氧核糖核酸進行不同螢光標記。
-
DNA測序儀
DNA序列測定分手工測序和自動測序,手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今 dna序列...
原理 發展歷史 試劑器材 操作步驟 計算 -
焦磷酸測序
焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是一種新型的酶聯級聯測序技術,焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析,其可重複性和精確性能與Sanger...