摘要
1 材料與方法
成為患者被迫放棄治療的重要原因。因此，保護骨髓，促進造血功能和免疫功能的恢復乃是腫瘤防治工作中的一個重要方面。當歸補血湯（Danggui Buxue Tang, DBT）為一傳統補益氣血經典方劑，臨床套用廣泛。我們及他人的研究已證明當歸補血湯可以增強正常小鼠免疫功能。本實驗以荷EL-4淋巴瘤C57BL/6小鼠為動物模型，研究當歸補血湯對荷瘤小鼠的影響，探討DBT抑瘤作用與免疫功能的關係。又採用荷瘤小鼠給予環磷醯胺化療的方法，造成荷瘤小鼠化療骨髓抑制模型，觀察當歸補血湯對接受環磷醯胺化療的荷瘤小鼠骨髓抑制及免疫功能的影響，為臨床套用提供更充分的理論依據。1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 動物 C57BL/6小鼠（H-2b），雌雄各半，10～12周齡，（20±2）g，購自北京大學醫學部動物實驗研究部；BALB/c小鼠（H-2d），雌雄各半，10～12周齡，（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
1.1.2 細胞株 MX-87、EL-4和L929細胞株液氮保存，均為北京大學醫學部免疫藥理研究室惠贈。
1.1.3 藥物 黃芪和當歸中藥飲片，均購自北京中醫藥大學國醫堂。按傳統方法水煎煮2次(黃芪∶當歸=5∶1)，混合後加熱濃縮成100%，即相當於含生藥量1 g/ml，置於4 ℃的冰櫃保存備用；注射用環磷醯胺（cytoxan, CTX），上海華聯製藥有限公司，生產批號041109，臨用前用生理鹽水配製成0.3 mg/ml溶液。
1.1.4 儀器與試劑 96孔細胞培養板，BIB公司產品；CO2培養箱，Napco公司產品；倒置光學顯微鏡，Nikon公司產品；∑960全自動酶標儀，華萼企業公司產品；ZT-Ⅲ像頭細胞收集器，紹興衛星機械有限公司產品。IPMI 1640培養基，Gibco公司產品；新生牛血清，HYclone公司產品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），Sigma公司產品。放射性同位素氚標記的嘧啶核苷（[3H] thymidine incorporation, 3H-TdR），中國科學院上海原子能研究所產品。綿羊紅細胞取自北京大學醫學部實驗動物科學部。自製補體（經小鼠脾細胞吸收的豚鼠血清）。其他常規實驗用試劑按常規配製。
1.2 實驗方法
1.2.1 荷瘤小鼠模型製備 參考文獻[1]製備荷瘤小鼠模型。取EL-4瘤株生長最佳狀態的傳代細胞，按細胞數5×106/ml，0.2 ml接種於10～12周齡C57BL/6小鼠近右後肢的背部皮下。
1.2.2 分組及用藥 腫瘤接種1周后，將荷瘤小鼠隨機分為4組：腫瘤模型組，DBT組，CTX組，DBT+CTX組，每組40隻，另設10隻正常小鼠作為對照。正常對照組和腫瘤模型組每天以0.5 ml生理鹽水灌胃和0.5 ml生理鹽水腹腔注射；DBT組以0.5 ml DBT[相當於生藥量24 g/（kg·d）]灌胃和0.5 ml生理鹽水腹腔注射；CTX組給予0.5 ml生理鹽水灌胃和0.5 ml CTX[7.5 mg/（kg·d）]腹腔注射；DBT+CTX組以0.5 ml DBT灌胃和0.5 ml CTX腹腔注射。每天用遊標卡尺測量並用下列公式計算腫瘤結節大小：瘤徑(mm)=（長徑+短徑）/2[1]。以上處理均連續進行15 d。各組內又隨機分為4組，每組10隻，用於不同指標測定，並給予相應處理。組內分成的4組中，一組留作生存時間觀測（採用中位生存時間[2]生存曲線圖表示）；一組進行免疫學相關指標及血象變化測定；其餘2組分別用於溶血空斑試驗和對同種異型抗原的遲髮型超敏反應測定。
1.3 檢測項目及方法 檢測項目主要包括：（1）腫瘤生長速度及荷瘤小鼠生存時間；（2）小鼠脾細胞抗體形成細胞，即空斑形成細胞（plaque-forming cell, PFC）[3]；（3）小鼠遲髮型超敏反應（delayed type hypersensitivity, DTH）[4]；（4）採用空斑減少實驗測定小鼠細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）活性[5]；（5）檢測小鼠自然殺傷細胞（natural killer cell, NK）活性[6]；（6）用L929細胞株細胞毒法測定鼠腹腔巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）[7]；（7）尾靜脈取血20 μl，測定白細胞和紅細胞計數，觀察外周血象變化；（8）脫臼處死小鼠，剝離股骨，每根股骨用Hank’s液反覆沖洗骨髓腔，顯微鏡下計數白細胞、紅細胞及骨髓有核細胞。
1.4 統計學方法 採用SPSS 12.0軟體處理數據，先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。組間比較採用單因素方差分析。
2 結 果
2.1 DBT對荷EL-4小鼠腫瘤生長速度的影響 連續給予相應處理15 d後，腫瘤模型組、DBT組、CTX組和DBT+CTX組腫瘤平均直徑分別為26.50、19.85、14.60和9.10 mm。與腫瘤模型組比較，以上干預（DBT、CTX和DBT+CTX）均可明顯減緩腫瘤生長速度，抑制腫瘤生長（P<0.05）。DBT+CTX組與CTX組比較，腫瘤生長速度差異有統計學意義（P<0.05），說明DBT可以增加CTX的化療效果，延緩腫瘤的生長速度。見圖1。（略）
2.2 DBT對荷EL-4小鼠生存時間的影響 連續給予相應處理15 d後，腫瘤模型組小鼠從接種腫瘤第21天開始出現死亡，生存時間最長只有28 d。DBT組小鼠接種腫瘤的第27天開始有第1隻死亡，最長生存時間為40 d，與腫瘤模型組比較，荷瘤小鼠生存時間顯著延長，說明一定劑量的DBT具有抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠生存時間的功效。CTX組與DBT+CTX組小鼠分別從腫瘤接種第30天、第35天起出現死亡，最長生存時間分別為48 d和57 d，與腫瘤模型組比較，CTX和DBT+CTX均可使荷瘤小鼠生存時間顯著延長。且與CTX組比較，DBT+CTX組荷瘤小鼠生存時間顯著延長，說明DBT還可以增加CTX的化療效果，使荷瘤小鼠生存時間延長。見圖2。（略）
2.3 DBT對荷瘤小鼠脾臟PFC的影響 用100%濃度的DBT 0.5 ml經灌胃給藥連續15 d，於給藥後第11天用5%綿羊紅細胞（sheep erythrocyte, SRBC）免疫小鼠，在給藥第15天后24 h內檢查脾免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）抗體分泌細胞數。結果表明，與腫瘤模型組比較，其餘各組荷瘤小鼠脾臟IgM分泌細胞數差異均有統計學意義（P<0.05）。與腫瘤模型組比較，DBT可顯著增強小鼠IgM分泌細胞數（P<0.05），但還未到正常水平，說明DBT能明顯增強荷瘤小鼠對特異抗原產生抗體的功能。
與腫瘤模型組比較，CTX可使小鼠IgM分泌細胞數顯著降低（P<0.05），比腫瘤模型組均值下降了50%；與CTX組比較，DBT+CTX可顯著增小鼠IgM分泌細胞數（P<0.05），可達正常對照組平均值的70%，說明DBT可以顯著增強給予CTX治療的荷EL-4小鼠脾臟B淋巴細胞對特異抗原產生抗體的功能。見表1。 表1 DBT對荷瘤小鼠脾細胞抗體分泌細胞的影響（略）
2.4 DBT對荷瘤小鼠對同種異體脾細胞的遲髮型超敏反應的影響 各組小鼠均給予相應處理15 d，腫瘤模型組小鼠足墊腫脹度平均為（0.7±0.1）mm，DBT組小鼠足墊腫脹度平均為（1.0±0.13）mm。DBT組與腫瘤模型組比較，遲髮型超敏反應明顯增強（P<0.05），甚至超過正常小鼠的足墊腫脹度平均值（0.9±0.2）mm，提示該方劑能增強荷瘤小鼠遲髮型超敏反應T細胞的功能。與腫瘤模型組比較，CTX組小鼠足墊腫脹度平均為（0.4±0.14）mm，遲髮型超敏反應明顯減弱（P<0.05）；DBT+CTX組小鼠足墊腫脹度平均為（0.85±0.17）mm，與CTX組比較，DBT+CTX可顯著增強小鼠遲髮型超敏反應（P<0.05），說明DBT可以顯著增強給予CTX治療的荷EL-4小鼠遲髮型超敏反應T細胞的功能。見表2。表2 DBT對荷瘤小鼠對同種異型細胞誘導 的遲髮型超敏反應的影響（略）
2.5 DBT對荷瘤小鼠CTL活性的影響 C57BL/6小鼠的CTL（H-2b）被絲裂黴素滅活的BALB/c小鼠脾細胞（H-2d）激活後，與MX-87靶細胞（H-2d）混合，溫育2 h後，計數空斑數。腫瘤模型組與正常對照組和DBT組比較，空斑數明顯增多，腫瘤小鼠CTL活性明顯減弱。通過計算，腫瘤模型組殺傷率為35.1%，DBT組殺傷率為47.3%，2組比較小鼠CTL活性差異顯著（P<0.05）。說明DBT具有一定的增強荷EL-4小鼠CTL殺傷功能的作用。
與腫瘤模型組比較，CTX組小鼠CTL殺傷率平均為19.0%，小鼠CTL活性明顯減弱（P<0.05）；DBT+CTX組小鼠CTL殺傷率平均為32.2%，與CTX組比較，DBT+CTX可顯著增強小鼠CTL活性（P<0.05），說明DBT可以顯著增強給予CTX治療的荷EL-4小鼠CTL活性。見表3。
2.6 DBT對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響 用EL-4細胞作為NK細胞的靶細胞，採用細胞增殖MTT法測定荷EL-4小鼠NK細胞活性，以殺傷率表示。腫瘤模型組小鼠NK細胞殺傷率為49.78%，DBT組小鼠NK細胞殺傷率為72.98%。DBT組與腫瘤模型組比較，小鼠NK細胞活性明顯增強（P<0.05），已達正常小鼠NK細胞活性的85.7%（正常對照組小鼠NK細胞殺傷率為84.21%）。說明DBT具有一定的增強荷EL-4小鼠NK細胞活性的作用。
與腫瘤模型組比較，CTX組小鼠NK細胞殺傷率平均為29.02%，小鼠NK細胞活性明顯減弱（P<0.05）；DBT+CTX組小鼠NK細胞殺傷活性平均為52.65%，與CTX組比較，DBT+CTX可顯著增強小鼠NK細胞活性（P<0.05），說明DBT可以顯著增強給予CTX治療的荷EL-4小鼠NK細胞活性。見表4。表3 DBT對荷瘤小鼠CTL活性的影響（略）表4 DBT對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響（略）
2.7 DBT對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞產生TNF-α的影響 採用對TNF-α敏感的小鼠成纖維細胞系L929細胞進行細胞毒實驗，MTT法作細胞增殖實驗，用酶標儀測定波長570 nm的吸光度（A）值，間接反映小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α生物學活性。TNF-α生物學活性高，對L929細胞的殺傷作用強，L929細胞增殖水平低，光密度（optical density, OD）570值低。腫瘤模型組所測OD570值為0.313，DBT組測得OD570值為0.253，可見腫瘤模型組小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的能力比DBT組小鼠較弱，差異有統計學意義（P<0.05）。提示DBT具有一定的增強荷EL-4小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的作用。
與腫瘤模型組比較，CTX組小鼠所測OD570值為0.409，TNF-α生物學活性明顯降低（P<0.05）；DBT+CTX組小鼠所測OD570值為0.291，與CTX組比較，DBT+CTX可使小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α生物學活性顯著增強（P<0.05），說明DBT可以顯著增強給予CTX治療的荷EL-4小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α生物學活性。見表5。
2.8 DBT對荷瘤小鼠外周血象和骨髓有核細胞的影響 尾靜脈取血，測定白細胞和紅細胞計數，觀察外周血象變化；脫臼處死小鼠，剝離股骨，每根股骨用Hank’s液反覆沖洗骨髓腔。顯微鏡下計數白細胞、紅細胞及骨髓有核細胞。CTX組與腫瘤模型組比較,白細胞、紅細胞數降低（P<0.05)，骨髓有核細胞數減少（P<0.05)，並且幾乎降至正常小鼠數值的50%以下；DBT+CTX組與CTX組比較，DBT+CTX則可使白細胞和紅細胞回升（P<0.05），骨髓有核細胞數增加（P<0.05)，數值可達正常小鼠的80%左右。說明DBT可拮抗CTX化療引起的荷瘤小鼠的骨髓抑制狀態。見表6。表5 DBT對荷EL-4小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的影響（略）表6 DBT對荷EL-4小鼠外周血紅細胞和白細胞及骨髓有核細胞的影響（略）
3 討 論
我們及他人的研究已經證明當歸補血湯能夠增強正常小鼠的免疫功能。本實驗以荷EL-4小鼠為模型，證實了DBT的抑瘤作用，結果表明相當於生藥量24 g/（kg·d）劑量下腫瘤生長速度顯著減緩，連續給予相應處理15 d後，其腫瘤直徑平均大小為19.85 mm，而腫瘤模型組腫瘤直徑平均為26.50 mm；並且荷瘤小鼠生存時間明顯延長，最長可達40 d，明顯長於腫瘤模型組的最長生存28 d。而相當於生藥量12 g/（kg·d）劑量下小鼠腫瘤的生長速度及小鼠的生存時間與腫瘤模型組比較，則差異無統計學意義（P<0.05）（數據未列出）。說明DBT具有抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠生存時間的功效，其作用與劑量相關。
中醫認為，機體之所以患腫瘤，正氣虛弱是重要原因之一，免疫功能降低，從而使抗癌能力下降，因此可用扶正益氣中藥治療調理。當歸補血湯具有益氣養血的作用，為扶正培本方劑。研究表明它對腫瘤細胞沒有直接殺傷作用[8]，其抗癌作用可能在不同環節、不同程度上增強機體的抗腫瘤免疫反應，通過增強免疫細胞[9]和免疫因子[10]的活性，而達到間接抗腫瘤的目的[11]。本實驗DBT抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠生存時間的事實又一次驗證了DBT的抑瘤作用可能與其激活機體各方面免疫功能的綜合作用有關這種觀點。
連續給予相應處理15 d後，DBT+CTX組小鼠腫瘤直徑平均為9.10 mm，而CTX組小鼠腫瘤直徑平均為14.60 mm，腫瘤生長速度顯著減緩；並且與CTX組相比較，DBT+CTX組荷瘤小鼠的生存時間明顯延長（p<0.05），最長生存時間為57 d，CTX組荷瘤小鼠最長生存時間為48 d，說明DBT可明顯增強CTX對小鼠移植腫瘤的抑瘤效果。
化療藥物多屬於細胞毒性藥物，對腫瘤細胞和正常細胞無選擇性。本實驗所用CTX是通過DNA為靶點殺傷腫瘤細胞，在殺傷腫瘤細胞的同時，導致增殖旺盛的骨髓造血細胞DNA結構破壞或阻止DNA合成，從而引起骨髓抑制[12]。免疫細胞屬於血細胞，來源於造血幹細胞[13]。因此化療造成骨髓抑制的同時，也表現為機體免疫功能進一步下降，嚴重影響治療效果。本實驗採用荷瘤小鼠給予CTX化療，造成荷瘤小鼠化療骨髓抑制模型，以研究DBT對化療所致骨髓造血系統的保護作用。中醫學認為，減輕化療的毒副作用應以清熱解毒、益氣養陰、補氣益血、和胃降逆和健脾補腎為原則[14]。傳統DBT由黃芪、當歸按5∶1比例組成，重用黃芪大補脾肺之氣，以滋生血之源，與當歸合用，養血和營，則陽生陰長，氣血兩旺。兩藥相伍，共同發揮補氣生血活血的作用，主治勞倦內傷、氣弱血虛之證[15]。我們的實驗結果提示，DBT對機體的獲得性免疫和固有性免疫均有重要的調節能力，對CTX所致的小鼠免疫和骨髓抑制毒性有明顯保護作用。提示臨床用CTX或其他化療藥物治療腫瘤時，同時套用DBT可降低化療藥物的毒副作用且可起到協同作用。
