肥胖抑制劑

肥胖抑制劑特異性表達於肌肉組織，屬於TGF-β超家族，是調控肌肉生長和發育的最重要的負調控因子，並同多種疾病有關。為獲得MSTN蛋白，製備多克隆抗體，深入了解MSTN基因的調控機理，將MSTN基因片段克隆入組氨酸標籤融合的表達載體pET-30a-c(+)中，IPTG誘導，利用金屬螯合親和層析(MCAC)進行純化，薄層掃描及Bradford法檢測純化蛋白的純度與含量；免疫家兔製備多克隆抗體，利用間接ELISA法檢測抗體效價，Western Blotting印跡檢測抗體特異性。經表達形式分析證明，融合蛋白大部分為包涵體，薄層掃描分析表明純化蛋白純度可達90％以上，Bradford法檢測蛋白濃度約5㎎／ml。抗血清效價可達1:250000以上，Westernblotting印跡檢測證明抗體特異性良好。結論：經誘導表達及純化製備出純度較高的MSTN蛋白產物，並獲得高效價特異性良好的多克隆抗體。
MSTN由骨骼肌表達進入血液以後，以自分泌或旁分泌的方式作用於骨骼肌，抑制骨骼肌的發育，而阻斷MSTN作用途徑可以顯著增強肌肉發育。為探討利用重組MSTN蛋白阻斷體內MSTN作用途徑，增強肌肉發育的可能性，本研究在體外成功表達並純化了MSTN蛋白的基礎上，將純化後的MSTN蛋白同佐劑充分混合後，免疫雌性昆明白小鼠。第三次加強免疫後第三天同雄鼠合籠。研究結果表明，免疫後對照組和實驗組母鼠體重差異不顯著；在妊娠後期，兩組之間體重出現差異，而分娩後，這種差異消失。仔鼠出生重在兩處理組中差異極顯著，實驗組仔鼠出生重較對照組增加25.8％左右，但在生長階段，兩組間體重差異有逐漸減少的趨勢。結論：套用重組MSTN蛋白免疫母鼠可以顯著提高初生仔鼠體重。
套用重組MSTN蛋白免疫小鼠可以誘導體內免疫反應，但由於MSTN在高等動物中高度保守，而且MSTN分子量較小，因而其抗原性也相應較弱。而B肝核心抗原是重要的載體蛋白，具有很強的免疫原性，能以T細胞依賴和T細胞非依賴作用方式產生免疫反應，並顯著增強其融合蛋白的抗原性。為進一步增強MSTN的抗原性，提高疫苗的免疫效果，本研究利用PCR方法獲得了MSTN羧端片段，並將其分別與B肝核心抗原的氨端、羧端或中間融合，構建了三個重組融合表達克隆：pET-30a-c(+)-SM／HBcAg(N)、pET-30a-c(+)-SM／HBcAg(C)和pET-30a-c(+)-SM／HBcAg(M)，並經IPTG誘導，在大腸桿菌BL21中實現了表達。利用金屬螯合親和層析(MCAE)進行純化。本實驗結果為進一步探討MSTN同HBcAg的最佳融合位點，增強MSTN的免役原性奠定了基礎。