絨毛膜尿囊移植,把從正常環境分離的胚胎或其它組織移植到雞胚的尿囊絨毛膜(CAM)上,使其在尿囊絨毛膜上繼續生長和分化,是分析發育的一種研究方法。如MaryRawles(1952)把早期胚胎的囊胚層仔細地分成一定部分,放在CAM上生長,再把移植體製成切片,檢查它們的組織來確定移植體中的組織類型,根據實驗結果就能把囊胚層各部分發育的潛能編成表。Weiss和Taylor(1960)套用CAM移植法去解答胚胎單個細胞的行為和相互作用。從較大的雞胚(孵育8-14天)器官中分離出細胞,離心細胞懸液使其聚集成團,然後再移植到CAM上。在CAM上進一步發育以後,把聚集的組織製成切片,發現它們又構成原來器官的組織特點。
簡介
例如,中腎聚集體發育成正常的腎小管,皮膚聚集體產生羽毛。因此證明了已進入分化階段的器官所分離的細胞仍然具有一種潛能,能再聚集並再構成正常的組織。發育生物學上還有許多研究涉及到CAM移植,甚至已證實從蛙到人的各種組織都能在雞的CAM上生長。但是這種技術與體外培養方法相比有些不同,體外培養必須在嚴格控制的條件下進行,而在CAM移植上,對研究的組織所提供的環境是不能精確確定的,隨著胚胎(宿主)發育,胚胎循環中的一些物質如激素會進入CAM上而影響移植體的發育。然而CAM移植技術比體外組織培養技術要容易的多,不需要那么複雜的準備工作。這個胚外位置對研究的組織進一步發育提供了非常有利的環境,胚外液體是合適的“培養基”。如果移植塊在CAM上成功生長的話,CAM上的血管將會長入移植體,為它提供氧氣和營養物,同時帶走代謝廢物。
本實驗介紹CAM移植技術,並進行早期胚胎組織的移植實驗。
實驗技術
一、宿主的準備
1.取孵育9-10天的雞蛋作為宿主。先逐個照蛋,以確定尿囊絨毛膜上血管呈“Y”形的部位。並在蛋殼上作標記。血管交叉點被認為是移植的最好位置。
2.在蛋的鈍端氣室處的蛋殼上用解剖針刺一個孔,這樣,在切開蛋殼時,尿囊絨毛膜會下降一些,膜的下降有助於防止在後面的操作中受到損傷。用酒精消毒雞蛋的鈍端,把探針插入約0.5cm深。做這一步時,必須小心控制探針,因為要用點力氣才能刺穿蛋殼,而這樣又很容易穿過氣室伸入胚胎。
3.在蛋殼上原已做了標記的地方,用單面刀片切割一個四方形的“視窗”,用透明膠帶封住它和鈍端小孔,將雞蛋暫放回孵育箱。
二、供體準備(圖12.1)
1.供體組織可以從不同胚齡的雞胚中取得。用早期胚胎(孵育36-48小時)的組織效果會更好,這是因為在發育過程中形態變化會更顯著。用孵育72小時或更大胚齡的雞胚組織,則容易切割供體和移植供體。但是無論是胚齡小或胚齡大的,移植眼睛、或孵育72-84小時雞胚的肢芽、或孵育5-6天胚胎的背部組織均會得到較好的效果。
2.供體胚胎在盛有HowardRinger溶液的培養皿中切割。先將胚胎與其下方的卵黃囊分離開,然後在供體上用二支解剖針,交叉解剖針,使針尖頂著盤底,象剪子樣彼此以相反的方向拉針,將供體組織切開。一個供體能作幾個移植體。
3.留下幾個與供體同齡的雞蛋,不作任何手術,在孵育箱中繼續發育,以便與相應的移植組織塊作對照。
三、移植組織塊
重新打開宿主雞蛋,集中光源於雞蛋“視窗”以便能看清尿囊絨毛膜上的“Y”字形區域。用鐘錶鑷子移植供體組織塊。把它放在血管交叉點上。也可以用細口吸管移植組織,但是吸管帶來的鹽溶液會造成組織漂浮而離開選擇的位置。如果移植塊滑出視線到視窗邊緣,或者找不到了,應該移植第二塊組織到此位置上。移植好以後儘可能快地重新封好蛋殼,防止雞蛋溫度下降太大和水份蒸發,把它放回孵育箱中。
四、觀察實驗結果
1.繼續孵育7天后,去掉透明膠帶,一片片地剝去蛋殼使“視窗”擴大,仔細觀察尿囊絨毛膜上移植體生長的情況。如果移植成功的話,在膜上很容易看到一塊較大的組織塊,假如沒有移植好,通常只能看到一塊小小的紅棕色或黑色斑點。
2.把成功的移植塊從尿囊絨毛膜上切下來,保存在10%的福爾瑪林中。
3.在解剖鏡下仔細檢查移植塊,繪畫每個草圖,測量大小,辨認分化的結構,並與孵育箱中未動手術的供體胚胎的相應組織進行對照,比較它們的發育程度和“正常性”。
實驗材料
1.實驗材料:
受精雞蛋
2.實驗儀器:
孵蛋箱、照蛋箱、單面刀片、解剖針、鐘錶鑷子、眼科剪、酒精燈、培養皿、解剖鏡、透明膠帶。
3.實驗藥品:
HowardRinger溶液,用前溫熱到孵育溫度。
70%酒精
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