發展歷程
正如眾多科學家所認可的，21世紀是生命科學的世紀。探索生命的奧秘，對於改善人類健康和促進經濟發展及社會進步都具有非常重要的意義。距離地球幾百公里以外的空間具有顯著不同於地面的環境。利用這樣的環境開展的空間生命科學和生物技術研究是生命科學研究的一重要研究領域，可能為人類開發巨大的空間資源做出重要貢獻。空間生物技術是上個世紀最熱門的一項空間科學研究，並從多個方面進行了探索研究。空間細胞生物技術的發展令人十分關注，其主要目標是用於研究、移植和生產生物藥物的細胞和組織工程。空間生物大分子生物技術則是另一個重要發展方向。
當前絕大多數的生物大分子的三維結構是用X-射線晶體衍射方法解析而得的。由於生物大分子特殊的結構性質，該結構測定方法的第一個步驟一一生長晶體是最關鍵的步驟，也是最困難的步驟，能否生長出合用的、較高質量的蛋白質晶體是結構測定成功與否的關鍵。生物大分子晶體生長是一複雜的動態過程，受多種物理、化學和生物學因素的影響。其中，重力驅使的沉降和對流等現象也會影響晶體生長的質量。然而，在離地面幾百公里的空間，重力水平只有地面的萬分之幾，甚至更低，我們稱之為微重力環境。在這樣的環境中生長蛋白質晶體，溶質對流和晶體沉降變得非常微弱乃至可以忽略不計，晶體處在穩定的溶液環境中保持原位生長，不再產生由重力導致的晶體堆集；此時，生長晶體周圍由於晶體攝取溶質分子而形成的溶質貧乏層能夠穩定地存在，而且厚度是地面上的幾倍，這使得晶體能夠在一個有利的環境中生長。溶液對流的消失還減少了雜質接近晶體的機會，使得晶體更純正。另外，在空間微重力條件下，還可以很方便地實施無容器或無器壁接觸的晶體生長，進而消除對晶體生長不利的器壁效應。因此，空間的微重力環境為蛋白質等生物大分子的晶體生長提供了理想途徑。
自 1981 年首次使用探空火箭得到 β-牛乳糖晶體至今的30 多年中,空間蛋白質的結晶研究取得了世人矚目的成就,研發了諸多空間結晶裝置 ,得到了數百種高衍射解析度的晶體,解析或最佳化了多種具有重要生物學意義的蛋白質三維結構 ,為結構生物學和人類健康作出了重要貢獻。
機理
（1）常重力下對流與沉降對結晶的不良影響
重力矢量是影響蛋白質複雜結晶過程的一個重要因素 ,在分子水平上與分子間作用力同樣重要 。它可在分子水平上影響鍵能 ,進而影響蛋白質相關的物理屬性。
在常重力場下 ,溶液界面的溫度和濃度梯度可引發浮力驅動的對流 。這種對流除了影響蛋白質分子正常有序的溶質傳輸過程外,其產生的擾動還會可破壞晶核周圍穩定的溶質缺乏區,改變蛋白質與沉澱劑溶液的平衡速度,影響晶核形成和生長。在常重力場下 ,當晶核生長達到約1μm 時 ,晶核生長的主導作用由布朗運動轉變為沉降作用 ,晶核會沿重力方向沉降至容器壁上繼續生長 。晶體與容器壁相互作用 ,產生較大內應力 ,妨礙了晶體 1 個或多個晶面的生長 ,尤其是緊密接觸器壁的晶面, 使晶體產生缺陷或扭曲。此外 ,沉降晶體之間可能會重疊或融合 ,由此產生大量缺陷晶體 。
（2）空間微重力環境可消除或減弱對流與沉降對結晶的不良影響
空間蛋白質晶體生長空間微重力環境並非0g ,現泛指 10 ～ 10 g ,太空梭或空間站上的重力水平可達到 10 ～ 10 g。這樣的環境中 ,由於浮力驅動的對流和沉降可被消除或大大減弱,晶核形成和生長攝取蛋白質後會在晶核周圍形成穩定的溶質缺乏區(Concentration-depletion zone ,CDZ)。從圖 1(a)中可看到,空間微重力環境下晶體周圍可形成穩定的溶劑化層和溶質缺乏區 CDZ 。從圖 1(b)中可看到 ,常重力下對流和沉降破壞了二者的形成 。在空間和地基用毛細管和光學方法證實了 CDZ 的存在。CDZ 中蛋白質過飽和度遠比母液中低,蛋白質分子被晶核捕獲需要更高能量和更長時間 ,致使晶體生長速率變慢。由於浮力驅動的對流和沉降被消除或減弱,溶質分子的傳輸僅靠緩慢的擴散過程 ,大約為 10 ～ 10 cm /s ,因此 ,蛋白質分子有充足的時間在晶格表面正確定位 ,有利於晶格的有序排列 ,從而可獲得高質量的晶體。在低過飽和度的 CDZ 中形成新晶核需要更高能量 ,因此較難形成新晶核 。這樣 ,溶液中的蛋白質主要用於原有晶核生長 ,不利於新晶核形成 ,從而減少了形核或二次形核的機會。
因為質量決定擴散速度 ,所以在沒有對流和沉降干擾的情況下 ,分子質量較蛋白質大得多的雜質難以接觸和結合到晶核上 ,減少了雜質引起蛋白質晶體缺陷的機會。在空間微重力環境下,由於對流被消除或大大減弱 ,晶體從形核到生長停止期間可靜止懸浮在溶液中某一相對固定的位置 ,避免了來自容器壁的不良影響 。晶體在各個方向上的生長是自由的 ,有利於等方性生長,易於形成形貌統一的較大單體。這些機制能在一定程度上解釋,在幾乎無對流和沉降的空間微重力環境下生長蛋白質晶體, 晶體數目減少 ,尺寸增大 ,晶體形貌和衍射質量明顯改善的現象 。凝膠介質中的蛋白質結晶研究結果也在一定程度上驗證了對流和沉降對蛋白質晶體生長的影響 。
（3）空間微重力環境可提高晶體衍射解析度
微重力環境可通過改善分子間堆積模式,增加晶體短程有序性來降低晶體漫散射,而且還可通過增加晶體尺寸、降低晶體鑲嵌度來增加晶體長程有序性,從而提高晶體衍射解析度。
（4）空間晶體有序水分子數目的增多
微重力環境下蛋白質晶體質量的改善程度可能與晶體溶劑的含量相關。蛋白質晶體質量是由晶體內三維有序化程度決定的 ,而水分子對穩定晶體內分子有序排列起著重要作用 ,特別是由弱作用力維繫的蛋白質分子周圍的有序水分子。蛋白質晶體溶劑含量越高 ,空間微重力環境改善溶劑結構的可能性越大。與地基對照相比 ,空間晶體中有序水分子、氫鍵數目和水橋明顯增多,且這種差異隨著與蛋白質分子距離的增大而增大。這是空間微重力環境改善蛋白質晶體質量的一個重要因素 ,可能與常重力條件下對流可帶走晶體表面的部分溶劑化層有關。
研究成果
對結構生物學的貢獻
利用X-射線單晶衍射技術解析蛋白質三維結構時,衍射解析度越高 ,解析得到的三維結構就越精細,從而能促使人們更好地理解蛋白質的功能及作用機制。與地基對照相比 ,20 %以上的空間晶體衍射解析度得到提高。通過對這些高解析度的空間晶體進行 X-射線衍射分析,解析或改善了多種具有重要生物學意義的蛋白質的精細三維結構 ,為結構生物學和人類健康作出了不容忽視的貢獻。
對晶體生長的積極影響
與地基對照相比 ,蛋白質在空間微重力環境下結晶時形核時間延長,形核及二次形核數目顯著減少 ,在容器壁上的異相形核顯著減少 ,晶體總生長速率降低,晶體尺寸顯著增大 。空間晶體有更好的形貌和光學性質(如透明性、雙折射性更好,雜質和缺陷更少)和更尖銳的布拉格反射 ,更低的漫散射, 衍射解析度顯著提高 ,鑲嵌度降低。空間晶體結合有序溶劑分子或水分子比地基對照顯著增多,B 因子降低,側鏈的位置更確定,暗示空間晶體的熱擾動和靜態混亂更少。
存在的問題與對策
(1)結晶成功率偏低
目前 ,空間蛋白質晶體生長的總成功率仍然較低。一方面是因為目前對蛋白質晶體生長機理尚不明晰 ,裝置設計還要受到太空飛行器條件限制,因此結晶裝置設計不合理 。另一方面是蛋白質結晶條件不合適。如果能研發出更科學合理的結晶裝置 ,有望大幅度提高空間微重力環境下蛋白質結晶的成功率。
(2)馬朗格尼對流的影響
在空間微重力環境中雖然對流和沉降可被消除或減弱,但是 ,在地基結晶中被掩蓋的馬朗格尼對流(Marangoni con-vection)會成為影響晶體質量的主要因素 ,尤其是在氣相擴散法中。人們認為馬朗格尼對流是早期廣泛使用氣相擴散法導致空間結晶實驗成功率低的原因之一,套用逆向擴散技術可有效避免馬朗格尼對流對結晶的影響 ,提高晶體質量。
(3)實驗機會受限 ,成本高昂空間蛋白質結晶受到太空飛行器發射機會的限制 ,實驗成本高昂。研發微重力環境地基模擬技術會提供一條較好的解決途徑。
(4)研究手段缺乏
目前缺少的研究手段主要是蛋白質晶體形核階段檢測與分析技術和在軌結晶實驗的自動化操作技術。
(5)微重力環境不穩定
太空飛行器上的重力水平並不像人們之前構想的那樣是靜止不變的,而是隨著太空人的活動及相關儀器設備的運行而波動 。模擬計算和有限實驗結果顯示,加速度大於 1μg時 ,即可對晶體生長產生擾動 。
(6)震動的影響
太空飛行器上產生的低頻振動可引起結晶溶液中的晶體移動和液體流動 。研發的震動隔離裝置可有效避免震動的影響 ,如微重力隔振技術手套箱等 。
(7)資助力度下降
在 20 世紀80 年代至今的30 多年中,儘管空間蛋白質晶體生長的研究已經取得了諸多令人歡欣鼓舞的結果 ,但是批評聲始終沒有停止過。目前西方已開發國家對空間蛋白質結晶研究資助的力度已大幅下降 ,國外空間蛋白質晶體生長的研究陷入低谷 。
未來的發展方向
(1)新型結晶裝置
根據通用、高效、便攜、無源的原則研發了空間蛋白質結晶新裝置。未來空間蛋白質結晶裝置的兩大發展趨勢為結晶室容量大 、便攜性好 ,結構簡單實用和硬體結構模組化,系統多功能性。結晶裝置的設計將更多基於逆向擴散技術, 以有效避免馬朗格尼對流對結晶的影響。
(2)新型監測技術
分析總結一些可用於蛋白質結晶監測的新技術 ,如監測溶液對流的條紋照相 、干涉法全息攝影術等 ;監測溶質傳輸速度的雷射都卜勒速度測量技術、顆粒影像速度測量技術等;監測結晶溫度的物理探針、液晶溫度儀等。
(3)搭載材料與次數選擇
搭載材料應重點選擇具有重要生物學意義且地基常規方法無法得到晶體或高質量晶體的蛋白質 。適當增加單種蛋白質的搭載次數可最佳化結晶條件,增加得到高質量空間晶體的機會。
(4)生長條件和生長時間的分隔控制
由於蛋白質分子的理化特性千差萬別 ,如果能根據蛋白質的不同性質來設定生長條件 ,在軌分隔控制各種蛋白質晶體的生長過程,可增加得到高質量空間晶體的機會 。
(5)增加凝膠的使用
凝膠可抑制對流, 促進蛋白質晶體的等方性生長 ,在運輸 、太空飛行器著陸 、冷凍等過程中保護晶體的光學和 X 射線衍射性能。
(6)加強機理研究
利用空間微重力環境探討重力等因素對晶體生長的影響 ,使人們能更好地利用空間微重力環境資源,豐富蛋白質晶體生長理論體系 。
(7)地基模擬技術
由於空間蛋白質結晶的實驗費用昂貴 ,實驗機會受限等原因,人們研發了一系列地基技術模擬空間微重力環境, 用於蛋白質結晶研究, 如空氣動力懸浮、液體界面懸浮、超聲懸浮、靜電懸浮、電磁懸浮及其組合套用。各種尺寸的毛細管和瓊脂糖凝膠也可模擬微重力環境蛋白質結晶的研究。強磁場是目前最好的地基模擬技術手段之一。
總體評價
任何事物都是在曲折中前進的,空間蛋白質結晶研究也不例外。雖然目前對此類研究的批評聲此起彼伏 ,許多已開發國家研究資助的力度已大幅下降,國際空間蛋白質結晶研究陷入低谷 ,但是我們不能無視那些已取得的驕人成績, 更不能因此而放棄它,空間蛋白質結晶的潛力還沒有被完全開發出來,尤其是國內研究才剛剛拉開序幕。
未來 ,我國建立自己的空間站後就可以持續地研究空間蛋白質的結晶 ,儘快促使我國在這一研究領域趕超國際先進水平,有力促進國內空間生命科學的發展 。我們應該客觀地看待其利弊,趨利避害,發現新問題, 總結新規律 ,更好地利用空間特殊環境優勢, 發展一種具有普適意義 、能提高蛋白質晶體質量的方法,以解決 X射線單晶衍射技術解析蛋白質結構的瓶頸問題,促進結構生物學的迅猛發展。同時, 深入探索微重力及各種因素對蛋白質結晶的影響及其機理,豐富蛋白質晶體生長的理論體系。
