PCR技術
PCR（PolymeraseChainReaction）技術即聚合酶 鏈式反應，也稱無細胞克隆系統，是1985年誕生的一項DNA體外擴增技術，該技術自問世以來，就以驚人的速度廣泛地套用於生命科學的眾多領域。基本原理與方法
PCR技術是一種利用DNA變性與復性原理，在體外利用DNA聚合酶活性，在引物的引導和脫氧核糖核苷酸（dNTP）等參與下將模板DNA在數小時 內進行百萬倍擴增。該技術利用兩段寡核苷酸作為反應的引物，以及四種脫氧核苷三磷酸dNTP、 DNA聚合酶作為反應物，將提取到的DNA（稱為模板DNA）片段精確擴增。該酶促反應最基本的3個 環節是：①模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變為單鏈DNA；②引物與模板鏈的特異性復性；③由TaqDNA聚合酶催化引物引導DNA鏈由5'向3'延伸，從而完成一個變性－復性－延伸的PCR循環。至此完成了PCR的第一輪反應，而後反覆進行變性、復性和延伸的循環，從而使擴增 DNA產量呈指數上升。
PCR技術在食品微生物檢測方面的套用
1．2．1單核細胞增多性李斯特氏菌
單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeriamonocy－toyenes，LM）是一種重要的人畜共患病致病病菌， 能引起人和動物腦膜炎、敗血症及孕婦流產等，且死亡率極高，可達30%～70%。LM廣泛存在於動物、水產品等中，主要通過食物進行傳播。過去對食品中LM進行檢測時，克隆培養的標準方法需要 3～4周的時間才能得出結果；血清學檢測方法（如 王鑫*車振明黃韜睿 （西華大學生物工程學院，成都610039） 分子生物學方法在食品安全檢測中的套用 Theapplicationofmolecularbiologymethodstechnologiesinfoodtesting * 王鑫，女，1983年出生，西華大學生物工程學院在讀碩士 研究生。 收稿日期：2007－05－14 WangXin*CheZhen－mingHuangTao－rui （Collegeofbioengineering，Xihuauniversity，Chengdu610039，China） 食品工程 FOODENGINEERING ?綜述評論? !!!!!!" !" !!!!!!" !" 7 同等學力分子生物學考試G蛋白偶聯受體胺基酸的類型、...2007年第3期 9月出版 ELISA等）也存在著特異性、敏感性差等問題。PCR 技術的出現給李氏菌的檢測帶來了曙光。姜永強等根據發表的單核細胞增生性李斯特菌的重要毒力基因hlyA的全基因序列，設計出引物，建立了該菌的PCR診斷方法。金大智等運用實時螢光PCR（Re－ al－timePCR）技術建立對食品中單增李氏菌進行檢 測的快速方法，設計的引物和探針的序列特異性強，省去凝膠電泳的繁瑣，降低了污染的可能性。對26種病原菌進行的檢測結果表明，用實時螢光 PCR法檢測單核細胞增多李斯特氏菌，更快速、敏 感、特異性更高。
1．2．2金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌腸毒素（SE）可引起人類中毒， 其內毒素———中毒休克綜合症毒素（TssT1）可引起中毒休克綜合症，產生的脫皮毒素（ETA、ETB）與一系列膿皰性葡萄球菌感染有關。Johenson等建立了檢測上述毒素基因的PCR技術，可在較短的時間內檢測出葡萄球菌毒株，並且具有極高的特異性、敏感性。國內雲泓若等選擇腸毒素D（SED）基因的第 360～381鹼基為上游引物，第654～675鹼基為下 游引物，套用PCR技術擴增出SED基因的316bp長的DNA片段，並建立了直接利用細菌裂解液作為模板的PCR方法。
1．2．3沙門氏菌
Nguyen等根據腸炎沙門氏菌C7克隆株具有的屬特異性序列（2．1kbHindIII片段）設計出一對引物， 能快速地檢測出肉食品標本中的沙門氏菌，檢測的敏感性和特異性均為100%，這保證了檢測的準確性。沈孝民用PCR技術對各種不同血清型的沙門菌和已知被該菌污染的魚粉和動物產品的肉湯培養物進行了檢測，結果顯示該方法特異性高，且靈敏、快速，並可在1d之內完成。
1．2．4腸毒素大腸桿菌
腸毒素大腸桿菌（簡稱耐熱菌）是一種嗜熱、嗜 酸、好氧的細菌，能從濃縮蘋果汁中分離得到，該菌能經受巴氏殺菌而存活，嚴重影響濃縮果汁的品質，國際上已有多起耐熱菌導致大規模果汁敗壞事件的報導。檢測結果的滯後性使之無法及時指導生產，無法及時向生產線反饋信息 以採取相應的防範、控制與清洗措施。 PCR技術能使微量的核酸在數小時之內擴增至 原來的數百萬倍以上，只要選擇適合的引物，就可特異性地大量擴增某一特定的DNA片斷至易檢測水平。因此理論上可以通過特異性地擴增耐熱菌的基因片斷而對其實現快速檢測。
PCR技術存在的主要問題及展望
PCR技術雖為一種快速、特異、靈敏、簡便、 高效的檢測新技術，但其在食品中致毒、致病性微生物檢測的實際套用中也存在不少問題，必須認真分析各種具體情況，採取必要的措施，以提高反應的特異性和敏感性，避免假陽性或假陰性結果。
1．3．1污染問題
PCR是一種極為靈敏的反應，一旦有極少量外 源性DNA污染，就可能出現假陽性結果，所以在操作時必須加以注意。
1．3．2假陰性問題
食品是複雜的反應基質，影響PCR反應的因素 很多，如果不能有效排除各影響因素的干擾，很可能出現假陰性結果。此外，如果在PCR操作過程中各種實驗條件控制不當，很容易導致產物突變，也會導致假陰性結果。對於這些問題必須有充分的考慮和排除措施。
1．3．3引物設計及靶序列選擇
引物的設計及靶序列的選擇是決定PCR結果的 關鍵因素，引物不同則擴增物不同，如果引物的設計不當，則直接影響對關鍵靶序列的選擇，降低 PCR檢測的靈敏度和特異性，甚至完全失敗。因而，必須對擴增序列有充分的了解，並規範PCR實 驗室操作技術。 儘管PCR技術在食品的微生物安全性檢測方面還存在著一些問題，但相信隨著研究的深入，這項技術必將得以完善，並迅速成為可以信賴的快速檢測手段。 2基因晶片技術 基因晶片技術是鑑別微生物和轉基因成分最有效的手段之一，為全面、快速、準確地進行食品安全檢測提供了一個嶄新的平台。基因晶片（DNA晶片、DNA微陣列）技術是近十幾年來在生命科學領域迅速發展起來的一項高新技術，是一項基於基因表達和基因功能研究的革命性技術，他綜合了分子 食品工程 82007年第3期9月出版 王鑫：分子生物學方法在食品安全檢測中的套用 生物學、半導體微電子、雷射、化學染料等領域的最新科學技術，在生命科學和信息科學之間架起了一道橋樑，是當今世界上高度交叉、高度綜合的前沿學科和研究熱點。
基因晶片技術
基本原理
將各種基因寡核苷酸點樣於晶片表面，微生物 樣品DNA經PCR擴增後，製備螢光標記探針，然後再與晶片上的寡核苷酸點雜交，最後通過掃瞄器定量和分析螢光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物。 該技術可檢測各種介質中的微生物，研究複雜微生物群體的基因表達。與傳統的檢測方法（細菌培養、生化鑑定、血清分型等）相比，基因晶片技術的先進性主要體現在：①基因晶片可以實現微生物的高通量和並行檢測，一次實驗即可得出全部結果； ②操作簡便快速，整個檢測只需4h基本可以出結果（而傳統方法一般需4d￣7d）；③特異性強，敏感 性高。2．2基因晶片技術在食品微生物檢測方面的套用
食品衛生檢測中一個重要的方面是及時準確的 檢測出食品中的病原性微生物，這些致病微生物的存在會嚴重威脅人類的健康。不潔或者帶有致病菌的食品不僅造成巨大的經濟損失，還會嚴重危害消費者的健康，從食品的生產、加工、運輸、銷售、消費的各個環節都極易被各種病菌污染。FDN統計表明，在抽檢的一部分食品中，過去5年由於受致病菌污染而從市場上撤回的食品數量增加了5￣6倍。中國在加入WTO後面臨同樣的問題，過去l0年中不僅發現了許多新的病菌，而且一些已知病菌也出現了抗性增強的趨勢；以前被認為無害的微生物在獲得致病基因和抗性後也會導致許多致命的疾病。由於缺乏合適的檢測方法，這些致病菌即使偶爾出現在食品中，也不能及時被檢測出來，對人類健康造成一定的威脅。食品微生物的檢驗是確保食品質量和安全的重要手段，因此加強對有害病菌的篩選與檢測，可有效防止食品被各種微生物特別是致病菌的污染和各種傳染病的蔓延。 傳統的生化培養檢測方法需要經過幾天的微生物培養和複雜的計數，操作繁雜，不能及時反映生產過程或銷售過程中的污染情況，且靈敏度不高， 使得食品的安全檢測潛在一定的危險，給消費者帶來很大的威脅；PCR法快速，比前者靈敏，但成本高，假陽性多，也不是很好的檢測食品微生物污染的方法。基因晶片可廣泛的套用於各種導致食品腐敗的致病菌的檢測，該技術具有快速、準確、靈敏等優點，可以及時反映食品中微生物的污染情況。國內外都已開始食品微生物檢測晶片的研究，並取得了一些肯定的結論。 基因晶片專一性好，能夠對食品中污染的微生物實現快速的線上檢測，及時反映食品中存在的問題，為危害分析的關鍵控制點（hazardanalysiscritical controlpoint）提供可行的權威性報告。 DNA晶片還能對農作物致病菌包括病毒、細 菌、真菌和線蟲迅速作出檢測，常常能達到株或屬的水平，保證食品原料的安全性；能對畜類、水產類進行微生物檢測；鑑別乳製品的好壞；檢測肉製品的優劣，真實判斷肉混合製品中某種成分的數量。從1993年開始，我國每年都會爆發對蝦流行性病毒病，其危害是災難性的，中國科學院海洋所的徐洪濤藉助DNA雜交技術，將該病毒的DNA作成探針進行雜交，從分子生物學角度證明白斑病毒感染是造成中國大陸對蝦連年爆發流行病的主要原因。
基因晶片技術存在的問題與展望
2．3．1存在問題
基因晶片技術的研究和套用前景十分誘人，但作為一項新技術，仍有一些問題需要解決：①該技術需要大量的已測知的、準確的DNA、cDNA片段的信息，他們使該技術成為大規模、集成化和整體獲取生物信息的有效手段；②由於晶片製作工藝複雜，信號檢測也需專門的儀器設備，一般實驗室難以承擔其高昂的費用；③樣品製備和標記比較複雜，沒有一個統一的質量控制標準；④實驗室不能共享數據和資料庫等。這些都在一定程度上限制了基因晶片技術在食品檢測中的套用。
2．3．2解決方法與發展方向
為使基因晶片成為實驗室研究或實踐中可以普 遍採用的技術，須從以下幾方面著手解決問題：①提高基因晶片的特異性、重複性；②簡化樣品製備和標記操作；③增加信號檢測的靈敏度；④研製和開發高度集成化的樣品製備、基因擴增、核酸標記及檢測儀器。另外，食品及食品原料中不斷出現的新轉入基因及食品病原微生物的複雜化，也是食品 9 2007年第3期 9月出版 檢測中套用基因晶片技術需要解決的問題。 基因晶片技術儘管存在一定的不足和局限，但該技術具有檢測系統微型化、檢測樣品微量化的特點，同時兼具檢測效率高、能同時分析多種基因或診斷DNA序列的優勢，很適於食品中病原微生物和轉基因成分的檢測及鑑定。隨著研究的不斷深入和技術的完善，基因晶片技術一定會在食品科學研究領域發揮越來越重要的作用。 3其他分子生物學檢測技術
核酸探針技術
核酸探針是指帶有標記的特異DNA片斷。根據鹼基互補原則，核酸探針能特異性地與目的DNA雜交，最後用特定的方法測定標記物。探針標記方式分為放射性標記、非放射性標記。放射性標記的核酸探針的特異性非常強，檢測病原微生物速度比常規方法快得多基因重組法
由於基因重組，尤其是轉化作用，僅出現於同 種或親緣關係十分近的菌株之間，所以基因重組技術可以用於細菌的分類和鑑定中。如用轉化法測定由食品傳染的、能引起痢疾的志賀氏細菌。基因重組法無需對待測菌株進行純培養，而且無需什麼特殊的試劑和設備，簡便易行，所以是一種很有前途的鑑定法。 4結束語 食品安全檢測中一個十分重要的內容是及時準確地檢測出食品中的病原微生物。傳統的微生物檢測方法雖然有效且特異性高，但存在檢測成本高、速度慢、效率低等問題，難以滿足現代社會快速檢測的要求，並且由於傳統的微生物檢測方法基本上都需要對病原菌進行人工培養，對一些生長緩慢或是新的病原菌就難以用傳統方法進行檢測。另外，對近些年來出現的轉基因食品中轉基因成分的安全檢測也難以用傳統檢測方法進行檢測。而基因探針術、PCR技術等作為現代生物學技術手段套用於食品微生物或食品中轉基因成分的檢測，克服了傳統 食品安全檢測方法的缺點和不足，而且還具有靈敏度高、操作簡便、檢測周期短、檢測成本低等優點。DNA探針雜交與PCR聯合使用檢測食品微生物將是今後食品微生物檢測技術的一個重要研究方向，若能克服兩者存在的易污染產生假陽性結果的缺失，相信大規模推廣套用指日可待。
