水飛薊提取物

水飛薊提取物以水飛薊Silybum marianum G.的乾燥果實為原料，商品提取物通常標化為含總水飛薊素80%。具有良好的護肝功效。

【生藥資源】
原產南歐至北非。我國華北、西北地區有栽培。
【生藥成分】
水飛薊中的主要有效成分是黃酮類物質,包括:水飛薊賓(Silybinin) A、B、水飛薊寧(Silydianin)、水飛薊亭(Silychristin)、Dehydrosilybinin、Isosilybinin A、B等,總稱為水飛薊素(silymarin),其化學結構式見圖7-1。
<IMG height=120 src="http://gongjushu.cnki.net/CRFDPIC/R200606249/r200606249.0210.9f5b33.png" width=321 onload=ReSizeImage(this); align=absMiddle border=0>
圖7-1 水飛薊賓的化學結構式
【性狀】淡黃色粉末,或結晶性粉末
【藥材質量】
水飛薊為菊科植物Silybum marianum(Linne) Gaertner的除去冠毛的乾燥成熟果實。
性狀:瘦果長卵形、稍彎曲、略扁;約6～7mm長、達3mm寬、厚約1.5mm。上表面有一突出的軟骨質狀、光滑、黃色邊緣;底部有一凹陷的種臍。果皮光滑、棕黑色或粗糙、灰棕色、帶有黑色或灰白色條紋。脂肪油和糊粉粒存於含有兩個厚、平子葉的直胚芽中。
顯微鑑別:果皮壁的表皮含幾乎無色的柵欄細胞,成直角狀排列至表面。有厚的外壁且縱裂的管胞。有粒狀增厚細胞壁似的增厚脊。果皮的表皮下層由非木質化的薄壁細胞組成,並構成一個色素層。無色細胞和數目不等的色素細胞交錯,因此看上去果皮的外表呈斑紋狀。果皮壁組織約8層細胞厚,且有薄壁細胞沿果實的縱軸方向零星分布。果皮的最裡層細胞可能壓破,含雪茄狀或單斜晶狀草酸鈣晶體。種皮由黃色的大柵欄細胞組成,細胞含一狹長的管胞,端點處略膨脹,細胞壁有明顯的分層。種皮的表皮下有特殊的點狀細胞,木質化細胞膜有明顯、禁閉脊或增厚(網狀細胞)。靠近其有一層細胞,細胞壁厚、略膨脹且有親脂性成分。胚由薄壁細胞組成, 可見小腺體、塊狀晶體和脂肪滴。
薄層鑑別: 供試液: 按 【分析方法】4項下 “樣品液製備”操作。標準溶液: 1.0mg/ml的水飛薊賓標準品的甲醇溶液。展開劑: 新鮮配製的氯仿、丙酮、無水甲酸的混合液(75:16.5:8.5)。檢測: 薄板在冷氣流中乾燥30分鐘, 噴以1:100的二苯基硼乙氧基胺甲醇溶液, 待乾; 再噴以5%的聚乙二醇4000; 1小時後於長波紫外燈下觀察, 供試液的一強綠藍色螢光帶、Rf值約為0.5(由於水飛薊賓的存在), 一灰藍色點, Rf值約為0.4, 與標準溶液的一個點相對應。供試液還顯示出其它色帶: Rf值約為0.25的強綠藍色帶 (次水飛薊素)、Rf值約為0.3的紅桔黃色帶 (黃杉素)。
薄層鑑別或符合DAB10規定。
其它有機物: 不超過2.0%。
乾燥失重: 將1.0g水飛薊粉末在105℃乾燥2小時, 減失的重量不超過12.0%。
總灰分: 1.0g水飛薊粉末測得總灰分不超過8.0%。
重金屬:不超過0.001%;或重金屬: Pb≤5ppm, Cd≤0.2ppm,Hg≤0.1ppm。
殺蟲劑殘留: 符合PHmV (1989)。
微生物限度: 總細菌數不超過10000個/g; 黴菌和酵母菌總數不超過100個/g; 沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌符合規定; 或符合DAB10: Ⅷ. N7, category 4a。
水飛薊素的含量: 本品以Silibin (C25H27O10)計不低於1.0% (DAB10)。注:美國藥典規定不得低於2.0%。
包裝及儲藏: 遮光, 防潮, 密閉。
【分析方法】
1. 分光光度法測定水飛薊素的含量
精密稱取本品粉末適量, 置50ml容量瓶中, 加入無水乙醇40ml溶解後, 定容, 搖勻, 精密吸取5ml置100ml容量瓶中, 加入無水乙醇至刻度, 搖勻, 同時做一空白對照。紫外分光光度計在288nm處測定吸光度。按下式計算含量:
水飛薊素含量%= <IMG src="http://gongjushu.cnki.net/CRFDPIC/R200606249/R200606249.0211.9F5B98.gif" onload=ReSizeImage(this); align=absMiddle border=0 imgpath="/CRFDPIC/R200606249/r200606249.0211.9f5b98.png">(以水飛薊賓計)×100%
A: 樣品吸光值; M: 取樣量 (g); V: 樣品稀釋倍數; 470: 水飛薊賓的吸光係數。
注:本方法源於遼寧省地方標準,適用於HPLC法測定值不低於60%的水飛薊提取物的含量測定。
2. 分光光度法測定水飛薊素的含量
精密稱取提取物精製品約250mg, 置50ml容量瓶中, 加入適量甲醇溶解後, 定容至50ml, 搖勻, 溶液即為被測液。
取1ml被測液於10ml容量瓶中, 加入2ml 2, 4-二硝基苯肼試劑, 搖勻, 塞上塞子,在50℃時加熱50分鐘, 冷卻, 加入氫氧化鉀的甲醇液至刻度, 搖勻, 靜置2分鐘。取1ml此液於離心試管中, 加入20ml甲醇, 搖勻, 離心。將紅棕色上清液倒入50ml的容量瓶中, 殘渣再加入20ml甲醇離心, 合併上清液, 用甲醇稀釋至刻度。
精密吸取1ml甲醇置10ml容量瓶中, 從“加入2ml 2, 4-二硝基苯肼試劑”起同法操作, 作為空白對照。
以空白溶液為對照,在490nm處測定被測濃度的吸光度A值,以E=537計算水飛薊素的含量。
3.分光光度法測定水飛薊素的含量(德國藥典DAB-9版1997)
標準溶液的製備:精密稱取水飛薊賓標準品25mg,置於5ml容量瓶,加甲醇溶解並定容至刻度,即得濃度為5mg/ml的標準品溶液。
樣品溶液的製備:稱250mg的水飛薊素至50ml容量瓶中,用甲醇溶解並稀釋至刻度,備用。
顯色溶液的製備:2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine)試液:稱此試劑500mg置於50ml容量瓶中,加H2SO41ml,用甲醇稀釋至刻度即得。
10%KOH溶液:稱10gKOH置於100ml容量瓶中。加水30ml,用甲醇稀釋至刻度即得。
測定法:取標準溶液、樣品溶液、甲醇各1 ml分別置10ml容量瓶中,並分別加入2ml的2, 4二硝基苯肼試液,三個容量瓶在水浴中50～55℃下反應50min,用自來水快速冷卻後,加KOH溶液至刻度,分別吸取上述三種反應後的溶液1 ml於10ml的具塞試管中,加甲醇10ml混勻,離心10min,上清液分別傾於50ml容量瓶中,離心沉澱再加甲醇10ml混勻,離心,上清液再分別傾於同一50ml容量瓶中,並重複一次,將三個50ml容量瓶均加甲醇至刻度。搖勻,於紫外分光光度計490nm處測定吸光度值。
<IMG src="http://gongjushu.cnki.net/CRFDPIC/R200606249/R200606249.0212.9F5BDA.gif" onload=ReSizeImage(this); align=absMiddle border=0 imgpath="/CRFDPIC/R200606249/r200606249.0212.9f5bda.png">
上式的計算是基於取樣操作嚴格按上述要求進行稱量的。如果稱量不能精確達到文中要求,則按如下公式計算:
<IMG src="http://gongjushu.cnki.net/CRFDPIC/R200606249/R200606249.0212.9F5BEE.gif" onload=ReSizeImage(this); align=absMiddle border=0 imgpath="/CRFDPIC/R200606249/r200606249.0212.9f5bee.png">
A1:樣品吸光值;A2:標準品吸光值;W1:樣品取樣量(g);W2:標準品取樣量(g);V1:樣品稀釋體積;V2:標準品稀釋體積
4.分光光度法測定水飛薊素的含量(美國藥典)
試液:將約1.0g的2、4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine),真空乾燥8小時,精確稱重,溶於2ml的硫酸中,臨時配置該溶液。
標準溶液的製備:將精確稱重的USP水飛薊賓標準品溶於甲醇中,製成約2.0mg/ml濃度的溶液。
樣品液製備:將約5.0g的水飛薊精細粉末精確稱重,置於一個提取套管,用小棉球塞住。將提取套管與連有連續提取裝置、含150ml的己烷250ml的圓底燒瓶連線,套管上加熱4小時,然後,將含己烷的圓底燒瓶與提取裝置分離,棄去溶劑,乾燥去除殘餘溶劑。再將提取套管與連有可連續熱提取裝置、含100ml乙酸乙酯的250ml的圓底燒瓶連線,套管上加熱回流8小時,減壓條件下,40℃鏇轉蒸發儀上揮發溶劑至乾。將殘餘物用25ml甲醇溶解,定量過濾至一50ml的燒瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。(注:此製備方法適用於藥材)
檢測: 分別將1.0ml的標準製備液和樣品製備液加入2個琥珀色的10ml燒瓶中, 準確標記, 分別加入2ml的試液, 混合。塞上瓶塞, 保持在50±1℃, 緩慢攪拌50分鐘。冷卻, 用甲醇稀釋溶液至刻度, 混合。分別取上述溶液2.0ml, 移至一100ml燒瓶中, 並加入3.0ml的羥化四氫銨甲醇溶液 (25%) &#91;注意: 羥化四氫銨臨時配製, 透明、無色溶液&#93;。用甲醇稀釋至刻度, 使燒瓶靜置30分鐘。同時在1cm吸收池、490nm處測定標準製備液和樣品製備液的吸收度, 甲醇溶液作空白, 並用以下公式計算水飛薊賓和水飛薊素的百分含量:
5000(C/W) (Au/As)
C: 為標準溶液中水飛薊賓的濃度 (mg/ml); W: 樣品製備液中所用乾燥水飛薊的重量 (mg); Au和As分別為樣品製備液和標準製備液的吸收度。
5. HPLC法測定水飛薊素的含量 (INA法)
色譜條件: 柱: YMC-Mark ODS C18 5u 4.6×150mm(或Phenomenex Luna C18 5u 4.6×150mm); 流動相: A液: 5ml磷酸加入995ml甲醇-水溶液(20:80), B液: 5ml磷酸加入995ml甲醇-水溶液 (80:20), 按表7-1程式洗脫; 流速: 1.0ml/min; 柱溫: 40C; 檢測波長: 288nm; 進樣量: 10μl。
標準品溶液的製備: 精密稱取真空乾燥的水飛薊賓10.00mg, 用甲醇溶解, 並定容至25ml, 即為對照品溶液。按1:2, 1:10, 1:25, 1:50比例稀釋。
供試品溶液的製備: 藥材 精密稱取約10g藥材細粉, 用100ml己烷於索氏提取器在水浴上提取4小時至色淡 (或無色), 提取液棄, 藥渣揮乾溶劑, 殘渣加入90ml甲醇置水浴上回流提取8小時, 提取液冷卻後定量至100ml, 稀釋25倍, 過濾, 濾液即為供試品溶液。
提取物 精密稱取提取物粉末70mg(精確至0.1mg), 加70ml甲醇超聲提取20分鐘,冷卻, 定容至100ml, 濾過。
測定法: 對照品溶液、提取溶劑、供試品溶液分別進樣, 見圖7-2。以標準品峰面積對濃度繪製曲線, 水飛薊賓A、B的線性相關係數應不小於0.999, 分離度不小於1.8。各組份的相對保留時間見表7-2。
表7-2 各組分的相對保留時間
組 分 YMC-Park Luna
計算:按上述各組分的總峰面積以水飛薊賓計量。
6. HPLC法測定水飛薊提取物中SilibininA、B的含量
色譜條件:預柱:2cm Bondapak C18/37-50Micron;柱:25cm RP18,5μm;流動相及洗脫程式見表7-3;流速:1.0ml/min;檢測波長:288nm;進樣量:10μl。
表7-3 流動相洗脫程式
時間 (分鐘) 5%醋酸甲醇溶液 5%醋酸
<IMG height=276 src="http://gongjushu.cnki.net/CRFDPIC/R200606249/R200606249.0214.4.png" width=400 onload=ReSizeImage(this); align=absMiddle border=0>
圖7-2 水飛薊提取物HPLC圖
供試液: 取0.05g提取物 (30%)溶於100.0ml甲醇中, 用0.45μm濾膜濾過即得。
對照液: 用甲醇配成含Silibinin約0.15mg/L的溶液。
以SilibininA+B峰面積外標 (%) 法計算。
7. 氣相色譜法 (頂空進樣) 測定水飛薊提取物中己烷和乙醇的殘留量
內標溶液: 精密稱取250mg戊烷, 加二甲苯定容於10ml量瓶。
校正液: 精密稱取100mg乙醇、己烷、戊烷, 加二甲苯定容於10ml量瓶。移取10μl溶液至頂空進樣瓶, 密封。
供試液: 精密稱取0.1～0.5g乾提取物, 置一個頂空進樣瓶, 加10μl內標液(相當於250mg戊烷), 密封。
頂空進樣參數: 溫度: 110℃; 溫度調節時間: 10分鐘; 壓力調節時間: 1分鐘。
色譜條件: 柱: DB-1矽膠毛細管, 30m×0.25mm內徑, 厚0.1μm。爐溫: 40℃保持7分鐘; 然後12℃/分鐘, 至180℃; 保持0.5分鐘; 30℃/分鐘至280℃, 然後保持10分鐘。進樣器: 150℃; 檢測器: FID250℃; 載氣: 氮氣(5psi); 分流比: 1:5; 積分停止時間: 25分鐘。
以內標色譜峰積分值進行定量, 按下式計算:
F=Ac×Ms/(Mc×As)
Ac: 參照標準品色譜峰面積; Ms: 內標的數量 (μg/μl); As: 內標的色譜峰面積;Mc: 參照標準品的數量 (μg/μl)。
含量 (mg/kg) =Ac×Ms×100/ (F×As×E)
Ac: 供試液中溶劑的色譜峰面積; Ms: 供試液中內標的數量; As: 供試液中內標的色譜峰面積; E: 取樣量。
注:檢測限:均為1ppm:保留時間:乙醇約5.5分鐘、己烷約10分鐘。
限度: 乙醇不得過0.5%、己烷不得過10ppm。
8. 氣相色譜法測定水飛薊提取物中丙酮殘留量
內標溶液: 精密稱取丙酮, 加水定容至6.00mg/ml。
校正液: 精密稱取丙酮, 加水定容至0.30mg/ml。
供試液: 精密稱取5g乾提取物, 加120ml水, 加熱, 加2滴消泡劑和5.00ml內標溶液。蒸發至約80ml。
色譜條件: 柱: OV101, 50m, 內徑0.32mm, 厚0.1μm; 爐溫: Sotherm at 30℃; 進樣器: 250℃; 檢測器: FID 250℃; 載氣: 氦氣; 流速: 1ml/min; 分流比: 1:70。
以外標色譜峰積分值進行定量。
注:檢測限:丙酮0.1 ppm;定量限:丙酮1.0ppm;保留時間:丙酮約4.7分鐘。
限度: 丙酮不得過20ppm
【質量規格】
1. 主要產品規格標準 (見表7-4)
表7-4 水飛薊提取物主要產品規格標準
規格 1 2 3
水飛薊素 (HPLC) ≥50.0%
水飛薊素 (UV) ≥80.0% ≥70.0%
組份
其它指標 Silibilin/Silymarin≥22/5
硫酸灰分≤2.0% Silibinin A+B≥30%
2.商品規格舉例
Milk thistle powdered Extract(80%)
(1) Manufacturing data
Botanical name: Silybum marianus GAERTNER
Part of plant used: Fruit without pappus
Solvent for Extraction: Acetone
Carrier: Maltodextrin
Ratio of botanical to native extract: 20～35:1
(2) Quality data
1) Physical and chemical data
Appearance: oily extract
Color: Brown to brownish
Odor: Characteristic
Taste: Characteristic
Solubility: Dissolve in Ethanol
Particle Size: Not less than 95% thru 80 mesh
Loss on drying (2 h at 105C):Not more than 5%
Ash: NMT 10.0%
Identification by TLC:Complies to standard; Method: Corresponding to DAB 10～2. Suppl.
Quantitative determination: Not less than 80% Silymarin by HPLC
2) Safety Data
microorganism:
Aerobic Bacteria: Not more than 5000 cfu/g (Total plate count)
Molds and Yeasts: Not more than 100 cfu/g (Total plate count)
Pseudomonas aeruginosa / Presence:None detected in 1 g
Staphylococcus aureus / Presence:None detected in 1 g
Escherichia coli / Presence:None detected in 1 g
salmonella Spp / Presence:None detected in 1 g
Other hazardous substance:
Residues of pesticides, radioactivity and aflatoxins:The raw material to be extracted meets thelimits forcontrolled substances
Residual solvent (by GC) :Less than 0.05% acetone
(3) Package/Storage
Storage:Cool,dry area; well closed container
Shelf Life: 24 months unopened
(4) Remark
Health hazards: See Material-Safety-Data-Sheet
【藥理作用】
1. 保肝作用
水飛薊素為保肝的主要活性成分, 具有再生作用, 可刺激新的肝細胞形成, 改善肝功能; 同時具有肝細胞膜保護作用, 預防細胞毒素浸潤肝細胞, 並提高膜結構缺損的恢復能力。
2. 抗氧化
水飛薊素的酚羥基提供氫原子而有強大的抗氧化作用。它們具有清除自由基特性,抗脂質過氧化活性。
3. 降血脂
水飛薊賓能抑制成年大鼠心肌細胞質膜Ca2+通道, 抑制食物誘導的血膽固醇過高,降低極低密度脂蛋白 (VLDL) 與低密度脂蛋白 (LDL), 升高高密度脂蛋白 (HDL), 可用於心血管系統疾病的治療。
【臨床功效】
水飛薊提取物主要用於病毒性肝炎、急慢性肝炎、肝硬化、高脂肪肝、營養代謝性疾病和心血管疾病。
【套用概況】
水飛薊提取物在國際上套用非常廣泛, 用於治療各種肝病的製劑有:美國LivaTone Plus公司生產的天補甘寶 德國Spitzner公司生產的Heplant薄膜片, 德國Bionorica公司生產的Silimarit膠囊, 德國馬道士公司生產的西利達寧 (Silidanin), 德國Merckle公司生產的Hepabene, 德國Kanoldt公司生產的Heliplant膠囊等。在國內水飛薊提取物也廣泛用作保肝利膽藥如“益肝靈片” (Ws3-B-1618-93), 由德國生產的水飛薊複方“Stomach Liver bile” 以商品名 “利膽丸”在我國上市。
(共8547字)
&#91;引用信息&#93;侯團章 編著.中草藥提取物·第一卷.北京：中國醫藥科技出版社.2004.第210-211-212-213-214-215-216-217頁.
【參考文獻】&#91;1&#93; The Official compendia of standards. USP, 2000, 2482
&#91;2&#93; Mark Blumenthal, et. al. The Complete German Commission Monographs-Therapeutic Guide to Herbal Medicines, 1998: 563