凝膠電泳操作簡便、快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度離心)所無法分離的核酸片段，是分離、鑑定和純化核酸的一種常用方法。
(一) 瓊脂糖凝膠電泳
1.原理 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩衝液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然後倒入膠模中，凝固後將形成一種固體基質，其密度取決於瓊脂糖的濃度。
將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩衝液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當時間後，大小、構象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離範圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。
2.瓊脂糖凝膠電泳的儀器及試劑 儀器設備應包括水平凝膠電泳槽及其配套電泳梳、穩壓電泳儀、微波爐或普通電爐。同時配備紫外線檢測儀和照相系統。
試劑包括瓊脂糖、電泳緩衝液、溴化乙錠溶液、凝膠加樣緩衝液。
電泳緩衝液常用tbe(1 000ml中含5.4g Tris，2.75g硼酸，2ml 0.5 mol/L EDTA，pH8.0)。
溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種螢光染料，它可以嵌入核酸雙鏈的配對鹼基之間，在電泳過程中隨核酸片段遷移，將凝膠置紫外光下，插入核酸鏈中的EB在紫外線激發下產生紅色螢光，可清楚顯示各核酸片段的遷移。EB見光易分解，應存棕色試劑瓶中於4℃下保存。由於 EB是一種強的誘變劑並有中度毒性，使用時必須戴手套操作。
常用的凝膠加樣緩衝液有4種，見表2-28：
| 表2-28 凝膠加樣緩衝液 | ||
| 緩衝液類型 | 6×緩衝液 | 貯存溫度 |
| Ⅰ | 0.25%溴酚藍0.25%二甲苯青40%（W/V）蔗糖水溶液 | 4℃ |
| Ⅱ | 0.25%溴酚藍0.25%二甲苯青15%（W/V）聚蔗糖水溶液 | 室溫 |
| Ⅲ | 0.25%溴酚藍0.25%二甲苯青30%（W/V）甘油水溶液 | 4℃ |
| Ⅳ | 40%（W/V）蔗糖水溶液 | 4℃ |
操作方法如下：
(1) 用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的塑膠盤的邊緣圈封，製成膠模，置水平工作檯上；
(2) 稱取適量瓊脂糖，置電泳緩衝液中，加熱使瓊脂糖溶解；
(3) 待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB貯存液，使終濃度達0.5mg/ml；
(4) 在距離膠模底板0.5-1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度約3-5mm，注意避免產生氣泡；
(5) 凝膠完全凝固後，移去梳子和透明膠，將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩衝液使恰好沒過膠面約1mm；
(6) 將DNA樣品與1/6體積加樣緩衝液混合後，加入樣品槽中；
(7) 接通電源，使樣品槽在負極端，用1-5v/cm的電壓，電泳適當時間；
(8) 電泳結束後，可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察，並拍照記錄，也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分鐘，再如上觀察和拍照，記錄結果。
4.凝膠攝影
需配置135照相機，全色135膠捲，照相機固定架，近攝鏡和紅色濾光鏡以及有機玻璃防護面罩。
操作需在暗室進行，將相機固定好，把凝膠放在紫外檢測儀上適當位置，調焦，裝上紅色濾光片，按常規拍照。
亦可使用凝膠自動處理系統，但儀器費用較高。
5.EB溶液的淨化處理
由於EB具有一定的毒性，實驗結束後，應對含EB的溶液進行淨化處理再行棄置，以避免污染環境和危害人體健康。
(1) 對於EB含量大於0.5μg/ml的溶液，可如下處理：
①將EB溶液用水稀釋至濃度低於0.5μg/ml；
②加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4 ，混勻，再加入等量的25mol/L HCl，混勻，置室溫數小時；
③加入一倍體積的2.5mol/L NaOH，混勻並廢棄。
(2) EB含量小於0.5μg/ml的溶液可如下處理：
① 按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時；
② 用濾紙過濾並將活性碳與濾紙密封后丟棄。
(二) 聚丙烯醯胺凝膠電泳
1.原理 聚丙烯醯胺凝膠通過丙烯醯胺單體、鏈聚合催化劑N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨以及交聯劑N，N’-亞甲雙丙烯醯胺之間的化學反應而形成。丙烯醯胺單體在催化劑作用下產生聚合反應形成長鏈，長鏈經交聯劑作用交叉連線形成凝膠，其孔徑由鏈長和交聯度決定。鏈長取決於丙烯醯胺的濃度，調節丙烯醯胺和交聯劑的濃度比例，可改變聚合物的交聯度。
聚丙烯醯胺凝膠電泳可根據電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達到分離目的，兼具分子篩和靜電效應，分辨力高於瓊脂糖凝膠電泳。可分離只相差1個核苷酸的DNA片段。
聚丙烯醯胺凝膠電泳用於分析和製備長度小於1kb的DNA片段。根據所要分離的核酸片段大小，可製備不同濃度的凝膠。
2.凝膠的製備和電泳 由於氧能抑制丙烯醯胺的聚合反應，灌制聚丙烯醯胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進行。在這種裝置形式下，僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸，從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯醯胺凝膠電泳一般採用垂直裝置。
凝膠的製備和電泳操作如下：
(1) 配製試劑
① 30%丙烯醯胺：100ml雙蒸水中含29g丙烯醯胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯醯胺。
② 5×TBE 每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。
③ 10%過硫酸銨：10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。
(2) 裝置膠模 將玻璃板和墊條事先用去污劑刷洗，並經自來水和無離子水沖洗乾淨，晾乾。裝置時，將較大的玻璃板平放在工作檯上，將兩個墊條放在玻璃板兩側，塗上少量凡士林，並將上層玻璃板置於墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其餘三邊套用防水膠帶密封。
(3) 根據玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量，按表2-29配製溶液(100ml)。
| 表2-29 聚丙烯醯胺凝膠溶液的配製 | |||||
| 濃度 | 3.5 | 5.0 | 8.0 | 12.0 | 20.0 |
| 30%丙烯醯胺(ml) | 11.6 | 16.6 | 26.6 | 40.0 | 66.6 |
| 水(ml) | 67.7 | 62.7 | 52.7 | 39.3 | 12.7 |
| 5×TBE(ml) | 20.0 | 20.0 | 20.0 | 20.0 | 20.0 |
| 10%過硫酸胺(ml) | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
(4) 立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡。
(5) 室溫聚合1小時，梳齒下出現折光帶時，表明聚合反應已經完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或濾紙(用1×TBE浸泡)包蓋於凝膠頂部，置4℃保存1-2天。
(6) 拔去梳子，立即用水沖洗加樣孔。
(7) 除去底部膠帶，將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅盡凝膠底部附著的氣泡。並用1×TBE溶液沖洗加樣孔；
(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩衝液(見表2-28)混合，並加入凝膠加樣孔中；
(9) 接通電源，正極與下槽連線。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過高時凝膠產生的熱量可造成DNA區帶彎曲，甚至引起小DNA片段的解鏈；
(10) 電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作檯上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，並小心揭下凝膠，置染色液中染色並進行結果觀察。
3.凝膠的染色和觀察 聚丙烯醯胺凝膠中核酸帶的染色，常用溴化乙錠法和銀染法。前者與瓊脂糖凝膠的染色方法相同。
銀染法的靈敏度較高，可如下操作：
(1) 將凝膠置固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)中固定10分鐘；
(2) 雙蒸水洗1-2次；
(3) 置0.01mol/L AgNO3溶液中，室溫反應15-30分鐘；
(4) 充分水洗；
(5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml 3%NaOH，含1ml甲醛)中反應至條帶顯色清晰，本底適宜；
(6) 用5%冰醋酸終止反應。
分子生物學實驗技術
| 分子生物學(molecularbiology) 是從分子水平研究作為生命活動主要物質基礎的生物大分子結構與功能，從而闡明生命現象本質的科學。而分子生物學的各種實驗方法，是本學科得以高速發展和不斷取得突破性成就的基礎。隨著學科的發展和各相關交叉學科的進步，分子生物學實驗技術必定會越來越高效與精準，成為人類探索自然、改善自然的有力工具。 |
