濃度測定
實驗目的
(1)掌握細菌培養技術，包括細菌的分離、培養，含菌量的測定。
(2)掌握細菌分離培養過程中的無菌操作。
(3)掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物MIC的基本步驟。能準確測出各種抗菌藥物的MIC值，了解單藥的抗菌活性。
(4)為棋盤法設計棋盤做準備，求取棋盤法的中心濃度。
實驗原理
抗生素在體外體系內能夠對細菌的生長起到一定的抑制生長的作用。
實驗準備
1、菌株：標準菌株或臨床分離菌株。
2、藥物及培養基：兩種抗菌藥(註明來源及含量)、MH肉湯培養基和LB營養瓊脂等。
3、器材：96孔細胞培養板、1ml和200μL移液槍、1ml和200μL槍頭、10ml刻度吸管、洗耳球、小試管、錐形瓶、容量瓶、小藥瓶加塞、試管架、平皿、接種棒、酒精燈、分析天平、自動高壓滅菌鍋、超淨工作檯和37℃恆溫箱等。
方法與步驟
1、實驗前的準備
(1)器具的清洗：將試管、平皿、錐形瓶、槍頭等實驗器具洗淨、包好，121℃、20min高壓滅菌，放烘箱烘乾備用。
96孔細胞培養板(不可高壓滅菌)用洗液浸泡、超聲、沖洗乾淨後，泡75%酒精備用(用前取出放超淨台吹乾，紫外殺菌2h以上)。
(2)試劑的配製：
圖1①磷酸緩衝液(PBS)的配製：見圖1。
②生理鹽水的配製：稱取0.9g NaCI於錐形瓶中，加入100ml蒸餾水，溶解。
③MH瓊脂、肉湯的配製：按照實際說明書的要求，稱取一定量LB瓊脂於錐形瓶中，加入100ml蒸餾水，溶解。按照試劑說明書的要求，稱取一定量MH肉湯粉於錐形瓶中，加入100ml蒸餾水，溶解。取瓊脂和肉湯分 裝於小試管中，每管2ml。
將配好的瓊脂、肉湯包裝好，121℃、20min高壓滅菌。待瓊脂稍冷後，在超淨台倒平板(15～20ml瓊脂平板)，凝固後置37℃恆溫培養箱過夜做無菌檢查，合格後和肉湯一起置於4℃冰櫃保存備用。
(3)藥物原液的配置及保存：各種抗菌藥用蒸餾水或不同pH的PBS稀釋至所需濃度，抗生素過濾除菌，化學合成藥高壓滅菌。分裝備用(圖2)。
圖2(4)菌液的配製：挑取標準菌株或臨床分離菌株，放入MH營養肉湯，37℃培養16～24h，第二天在LB營養瓊脂平板上劃線培養16～24h，第三天挑單個菌落接種於2ml MH營養肉湯中，溫箱培養16～24h，製得供試菌液 。
細菌含量測定
(1)用生理鹽水將上述菌液做10倍梯度稀釋(0.5ml菌液+4.5ml生理鹽水)。
(2)取10 、10 、10 三個滴度的菌液各0.1ml滴在瓊脂平板中央，輕輕拍打，使其均勻攤開，不要接觸平皿邊緣，每個梯度做2個平板，放入37℃溫箱培養16～24h。
(3)計算菌落數：挑選長有30～300個菌落的平板來計數。兩個平板的計數結果取其平均值為細菌濃度，要求生長濁度達9 x 10 個/ml。計算示例：10 兩個平板上生長菌落數分別為68、70個，平均69個/0.1ml，則1ml含活菌落數690×10 個/ml，即生長濁度為6.9×10 個/ml。
(4)將供試菌液(3步製得)用肉湯做1：10000稀釋(最終的濁度為10。)。
抑菌濃度測定
(1)在96孔培養板的前3排(即A、B、C 3排)每孔中各加入含TTC(5%)的空白肉湯100μL。
(2)在A、B、C 3排的第1孔加配好的藥液(濃度為512IU/ml或μg/ml)100μL，然後對藥物進行二倍稀釋，即第1孔中加入藥液後用移液槍充分吹打(至少3次以上)使藥物與肉湯充分混勻，然後吸取100μL加入第2孔，再充分吹打使之與肉湯充分混勻，同樣吸取100/μL加人第3孔中．照此重複直至最後一孔，吸取100μL棄去；此時每孔藥物濃度從左到右依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 IU/ml(或ug/ml)。
(3)再在每一孔中加入稀釋好的菌液100μL，這樣就形成測定一個藥物MIC值的3次重複(A、B、C 3排樣品)。此時每孔藥物濃度即最終藥物濃度，從左到右依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125、0.06 IU/ml(或μg/ml)。
(4)另外在同一塊板上做一排陰性對照(僅加空白肉湯不加菌液)和一排陽性對照(加菌液肉湯不加藥液)。
(5)將96孔培養板放入37℃恆溫培養箱培養16～20h後，觀察結果。
實驗結果與分析
圖3將實驗結果填入圖3和圖4，並分析原因。
兩種菌介紹
最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration)常分別縮寫為MIC或MBC，單位以μg/ml或mg/L來表示，為最小抑制病原微生物繁殖或殺滅病原微生物生存的藥物濃度，用於衡量抗感染藥(包括抗生素、抗菌藥、化學合成藥)抵抗病原微生物的能力。
使用抗感染藥治療的最終目的是根除人體被感染部位的病原微生物，從微生物學角度看是通過達到和維持一定的抗感染藥的濃度來實現的，抗感染藥在體內或體外的濃度要達到或超過MIC，才能抑制病原微生物的生長；濃度要達到或超過MBC，才能殺滅病原微生物。當然，其濃度數值越小，其抗病原微生物的活性越強。
與此相對應的有MIC或MIC、MBC或MBC，分別為抑制50%或90%病原微生物繁殖或殺滅50%或90%病原微生物生存的最小濃度 。
圖4