掃描免疫電鏡技術

免疫電鏡技術是免疫組織化學技術與電鏡技術結合的產物，是在超微結構水平研究和觀察抗原、抗體結合定位的一種方法學。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術，即採用抗原抗體凝集反應後，再經負染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位 技術。該項技術是利用帶有特殊標記的抗體與相應抗原相結合，在電子顯微鏡下觀察，由於標準物形成一定的電子密度而指示出相應抗原所在的部位。免疫電鏡的應 用，使得抗原和抗體定位的研究進入到亞細胞的水平。

掃描免疫電鏡技術可為研究細胞或組織表面的三維結構與抗原組成的關係提供可能性。
（一）原理免疫電鏡技術是免疫組織化學技術與電鏡技術結合的產物，是在超微結構水平研究和觀察抗原、抗體結合定位的一種方法學。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術，即採用抗原抗體凝集反應後，再經負染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術。該項技術是利用帶有特殊標記的抗體與相應抗原相結合，在電子顯微鏡下觀察，由於標準物形成一定的電子密度而指示出相應抗原所在的部位。免疫電鏡的套用，使得抗原和抗體定位的研究進入到亞細胞的水平。
（二）標記物
套用於掃描電鏡的標記物應能在掃描電鏡可分辨的範圍內，並能對細胞或組織抗原有較好的定位能力。在選擇標記物時應根據研究目的而定，如標記細胞等由於體積較大，可用體積大的標記物；如鑑別陽性（標記細胞）與陰性（未標記細胞），而要定位受體等則需選用較小的，易於辨認的標記物。
常用的標記物為顆粒性標記物。依其特性可分為：
1．蛋白類如血藍蛋白、鐵蛋白等。
2．病原體類如菸草花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、噬菌體T4、大腸桿菌f2、噬菌體等。
3．金屬顆粒膠體金、免疫金銀標記技術和同位素放射性自顯影的銀顆粒等。其中以金屬類顆粒標記物套用最為廣泛。最常用的是膠體金，膠體金商品提供的直徑從3～150nm不等，掃描免疫電鏡常用的金顆粒直徑在30～60nm左右為宜。由於金本身系重金屬，有較強的發射2次電子的作用，故不需噴鍍金屬膜，這是膠體金套用於免疫掃描電鏡的標記優於其它標記物之處。免疫金銀染色能加強細胞或組織表面金屬顆粒聚集的密度。金、銀粒在電鏡顯示為電子密度高，外形清晰的顆粒易於識別和定位。病原體標記物主要利用其特異殊的外形和結構以達到標記定位的目的，如噬菌體T4形似星形的球拍，頭部大約100nm直徑，呈六角形星狀，尾長約100nm，由頸部與頭部相接；菸草花葉病毒為15×30nm的桿狀病毒，而南方菜豆花葉病毒是直徑25nm的園形顆粒，這些病原體的典型外形很易於辨認。鐵蛋白由於含有緻密的鐵離子核心具有較高的電子密度，從而達到標記定位的目的。血蛋白是由海螺類軟體動物中提取的多分子聚合物，其外形為35×50nm的柱狀體，多套用於病毒研究，但也有利用血藍蛋白與過氧化物等的糖蛋白部份可與凝集素相結合的特性，進行細胞膜受體的定位。
（三）免疫標記方法
金屬類標記物的免疫標記法同切片免疫染色，即將標記物與抗體相結合，通過直接或間接法顯示抗原部位。膠體金可與蛋白A相結合後與IgG分子中的Fc段相結合。再與卵白素（a－vidin）相結合可與結合抗體的生物素（biotin）反應。免疫金銀染色法在膠體金標記後，再進行銀液顯影。病毒（包括噬菌體）標記物多採用不標記抗體法，即搭橋法。此法的原理是採用同種動物製備抗原的特異性抗體與標記物抗體（例如兔抗A抗原與兔抗HRP）。再用另一種動物製備第一種動物血清抗體的抗體（例如羊抗兔IgG抗體）。利用後者為橋，把抗原的特異性抗體與抗標記物抗體結合起來，後者再與標記物結合，以達到定位抗原的目的，其基本原理與PAP法類同。病原體免疫標記可不用標記物顯示，而利用其形態學特徵定位或採用抗原抗體凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特異性抗體在與相應的抗原反應後，使後者之間發生交聯而凝集，經濃縮後用陰性染色法（負染）便可在電鏡下顯示定位。